基因工程的發展-免費閱讀

　　

【正文】 實驗性質分子克隆的一般程序包括以下幾步： （ 1）分離供體 DNA或 RNA（ mRNA）和載體 DNA （ 2）構建基因文庫或 cDNA文庫 （ 3）目的基因或 cDNA 克隆的篩選 （ 4）目的基因或 cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結構分析等 （ 5）基因表達與調控機理的研究1) 建立文庫用載體 常在 進行 小 — 質粒載體，操作方便，鑒定簡單 大 —λ 或 cos質粒載體 , 甚至 pYAC載體 (為減少文庫規模，即使基因組小的也可用 λ 和 cos載體） ⅰ) 互補法：可表達 ,選一般載體 。選擇克隆載體的幾個重要參數（ 1）實驗對象 （ 2）實驗性質（ 3）載體容量（ 4）合適克隆位點（ 5）載體的穩定性（ 6）載體 DNA制備的難易（ 7）外源基因表達產物產量、產物特點等2.Tcr為重組子 (AprTcr)用于構建 cDNA文庫 顯然 ,+a.克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）；1)1)（ 1） .分別由兩個基因編碼。5） β— 半乳糖苷酶基因（ lacZS亞基上，阻止蛋白質合成。Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。AAs蛋白質，與細菌細胞膜結合， 阻止四環素分子進入 細菌細胞。Tetr有的基因是不能用作選擇性標記基因（ lacZ等）。這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性的（如 TcS， 1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進入宿主細胞（三）遺傳標記基因 （二）載體特點 et1. 根據每個寄主細胞中質粒拷貝數的多少，把質粒分為嚴緊型復制質粒（拷貝數少，為 15個）與松弛型復制質粒（拷貝數多，可達 10200份拷貝）。T4AAGCTT3’T4AHOPAGCT限制酶與其它酶共同作用結果 1)用途：5’5’引物 5’對 95℃ 高溫具良好穩定性，該酶不存在3’→ 5’外切酶活性2.聚合酶活性 4000nt/min其中用途 2)要求 3’ OH引物和模板 DNA，其延續性受反應條件的影響1）具兩種外切酶活性和 DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具 5’ →3 ’ 外切酶活性，大片段具 3’→5’ 外切酶活性 (大片段亦稱為 Klenow片段 ,2.Ca2+作用于 DNARNA雜交分子中的 RNA鏈，用于 cDNA文庫建立時除去 RNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成。核酸酶 S7， 亦稱微球菌核酸酶，對 RNA敏感，用于除去蛋白質合成系統中的內源 mRNA大部分用于 RNA的核苷酸序列分析或除去 DNA樣品或蛋白質合成系統中的 RNA分子。339。cExoIII用于順序缺失bc3ac13ac13aRNaseHExoIII的外切酶和 RNaseH的作用1P539。HO339。P539。5.1)4)外切酶活性： 3’→ 5’，產生 5’單磷酸核苷酸和具各種結構的 來自于 ，分子量 28,000BamHI（ GGATmCC） MepI（ mCCGG）GAmATTC— EcoRI(G?AATTC)相同2.AATTC在 DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于 II型，它與相應的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。酶切圖譜的構建（ a）請構建該環狀DNA分子的酶切圖譜酶切圖譜的構建（ b）二、 DNA甲基化 酶（ 一）、 1.CCCGAG。5’CPyCGPuG3’ｂ）能識別簡并順序的，如： AvaI3’CCTAC(Ｎ )135’SmaI3’CTTAAG5’G3’5’CTGCA2.TN１）識別４ 8個相連的核苷酸命名 ： 限制酶由三部分構成，即菌種名、菌系編號、分離順序。3.DNA核酸聚合酶 — 用 于 DNA和 RNA的合成 基因治療人數情況生物技術產業化 — 農業領域已有 35個科 120多種植物獲得轉基因植物，一些重要的農作物獲得商品化的轉基因品種。29產品數量 410元 /ug巨細胞粒細胞集落刺激因子 開發成功一個新的生物藥品 ,環境傳統微生物發酵、基因工程菌發酵、動物細胞培養、植物細胞培養發酵類型： 目標就是通過工程化技術大規模生產和轉化相應原料成為有用物質的技術。從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組 DNA分子的受體細胞克隆。manipulation)。 基因工程的概念及其主要內容第二節 重組體的篩選第七節 分子克隆 (molecular二、基因工程的主要內容或（步驟）從復雜的生物有機體基因組中，經過酶切消化或 PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的 DNA片段。蛋白質工程主要內容主要目標液體發酵、固體發酵、固定化培養、流式發酵發酵技術設備生物技術的應用領域醫藥： 環 境生物技 術 重點用于清除危 險廢 棄物 每一步都可能失敗，而前功盡棄高回報 :世界轉基因作物大田釋放情況()轉基因作物特性 批準項數 所占比例抗除草劑 1297 %抗蟲 1046 %提高產品質量 886 %抗病毒 436 %改善農學性狀 211 %抗真菌病 208 %其他 303 %總計 4387 100%轉基因作物種植面積生物技術與傳統中藥中藥現代化 —— 核心是建立與現代基因學說相應的現代中藥理論現代中藥理論的建立 —— 確立中藥與基因表達的關系 DNA甲基化酶 — 用 于 DNA分子的甲基化 I型 ： 由三個基因構成， hsdR； hsdM； hsdS（hostspecificity）位于染色體上，三個基因構成一個復合體，限制酶需要 ATP、Mg2+、 SAM（５ — 腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點。上述三個系統中，只有 II型限制酶與甲基化酶具有相當高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。PuGG(A/T)CCPyN２）富含ＧＣT１） ３ ’端突起 ，個數為２或４個核苷酸3’CTTAAPHOG5’在進行 DNA重組時，應用限制酶同時切割目的基因和載體 DNA，使之產生相對的粘性末端，然后再將二者連接成重組 DNA分子5’CCCGGG3’3’GGG４）非互補的粘性末端IC定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制 2）切割位點的異同 KpnIGGG限制酶的用途4.具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結構。4.GACII型甲基化酶對限制酶活性的影響 抑制不同種限制酶的活性順序邊界重疊 抑制不同種限制酶的部分活性2.3)堿基釋放速度： CATG2)HOHOP 539。HO339。P53