基因工程的發展(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 mHI(G?GATCC)GAmATTC— EcoRI(G?AATTC)２） 抑制不同種限制酶的活性a.順序完全重疊 如： M.ClaI（ ATCGmAT） TaqI（ TCGmA）b.順序邊界重疊 如： M.BamHI（ GGATmCC） MepI（ mCCGG）３） 抑制不同種限制酶的部分活性M． TaqI（ TCGmA） HindII（ GTPyPuAC）：GTCAAC， GTTAAC， GTCGmAC， GTTGAC3.甲基化酶的用途 １） 改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成２） 在建立基因文庫時，可先使 DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切 CH3CH3CH3RE RE RE RE RERE RERERE RERECH3 CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭 RE用于基因組文庫的建立用于 cDNA的連接RE RE RE三、核酸酶（ 一）、外切酶 III（ ExoIII）1.一般特點： 來自于 ，分子量 28,000kD2.催化反應類型1)外切酶活性： 3’→ 5’，產生 5’單磷酸核苷酸和具各種結構的 dsDNA， pH2)核酸酶 H活性：除去 DNARNA雜交分子中的RNA分子， pH3)3’磷酸酶活性：除去 3’磷酸基后形成 3’OH端，有利于 DNA聚合酶反應， pH4)內切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將 DNA鍵切開， pH3.外切酶活性特點1)反應底物：互補 dsDNA2)堿基釋放速度： CATG3)反應產物： 5’單磷酸核苷和具缺口或 5’端突起的dsDNA，過度反應將導致 DNA降解4.用途 1)核酸（ DNA）標記2)基因突變 缺失3)DNA序列測定時作順序缺失5.使用注意事項1)正式使用前，測定在一定條件下酶的反應速度2)在一定條件下， ExoIII不能作用 GC富集區 (來自于 cDNA加尾 )dsDNA結構 :切口 ,缺口 ,斷口缺口 (gap)切口 (nick)斷口 (cut)339。HOP539。 339。HOP539。539。P 539。P539。P 539。P539。P339。HO 339。HO339。HO339。HO339。HO339。HO339。HO339。HOOH339。 OH339。OH339。OH339。P539。P539。 P539。P539。P539。P539。P539。339。HOP539。OH339。P539。RNaseHExoIII的外切酶和 RNaseH的作用1234abc 1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于順序缺失ExoIII ExoIII [α 32P] [α 32P] dCTP dCTP 539。PP539。539。PP539。339。HOOH339。339。HOOH339。ExoIII用于DNA標記（二）、 Rnase（三）、 RNaseH（二）、 RNase大部分用于 RNA的核苷酸序列分析或除去 DNA樣品或蛋白質合成系統中的 RNA分子。1.RNaseA分離自牛胰臟，對熱穩定，抗去污劑（ 100℃加熱 15min仍具活性） ,用于除去 DNA樣品中的 RNA分子2.核酸酶 S7， 亦稱微球菌核酸酶，對 RNA敏感，用于除去蛋白質合成系統中的內源 mRNA（三）、 RNaseH作用于 DNARNA雜交分子中的 RNA鏈，用于 cDNA文庫建立時除去 RNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成。 （四）、 DNaseI1.特點： 具內切酶活性，作用于 dsDNA，但無核苷酸序列特異型，產生 5’P低聚核苷酸 。Ca2+,Mg2+或 Ca2+,Mn2+可使酶活達最大值當酶濃度很低時， dsDNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響： Mg2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關， Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置2.用途1)切口移位，制備 DNA探針2)制備 RNA樣品時除去 DNA分子3)基因突變時產生切口 Mn++存在時 Mg++存在時 DNaseI作用特點DNaseIHOP 5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位 PolI四、 DNA聚合酶（一）、 DNA聚合酶 I（ polI）1.的 DNA聚合酶系統PolI參與 DNA修復 ,具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性polII同上 具 3’→5’ 外切酶活性polIII參與 DNA復制 ,具 3’→5’ 和 5’ →3 ’ 外切酶活性2.polI的特點 1）具兩種外切酶活性和 DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具 5’ →3 ’ 外切酶活性，大片段具 3’→5’ 外切酶活性 (大片段亦稱為 Klenow片段 ,polIK)2） 聚合酶活性， 5’ →3 ’ ,要求 3’ OH引物和模板 DNA，其延續性受反應條件的影響3） 外切酶活性 3.用途 1） 除去 3’端突起的單鏈 DNA（在無 dNTP時）2） 補齊 5’突起端3） 合成第二條 cDNA4） 切口移位制備探針 其中用途 2)和 3)常用大片段（二）、 T4DNA聚合酶1.特點：5’ →3 ’ 聚合酶活性， 1500nt/min,為 polI的兩倍 3’→5’ 外切酶活性，可作用于 ssDNA和 dsDNA,其切除速度分別為 40和 4000nt/min2.用途：制備高比活性探針 (1010cpm/μgDNA)。DNA末端修飾 缺失外切酶活性 聚合酶活性 無 dNTPdNTP（三）、 TaqDNA聚合酶1.特點：分離自水生棲熱菌，分子量為 94,000，最適反應溫度 75℃ ， 對 95℃ 高溫具良好穩定性，該酶不存在3’→ 5’外切酶活性2.用途：主要用于 DNA的體外擴增，經 25次循環后才進入酶的反應穩定期，一個 DNA分子因而可被擴增 4106倍。DNA擴增技術又稱為 聚合酶鏈式反應 ，它包括以下三個步驟：DNA模板變性 (95℃) → 與 DNA引物退火 (45℃ )→ 引物延伸 (75℃) TaqPol和 PCR 5’3’變性 3’160