微生物實驗室操作指導(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 了食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法。本文適用于航空食品的檢驗。2 設備和材料吸管（1ml、10ml）、恒溫培養箱（36177。1℃、177。℃）、冰箱、均質器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡等3 培養基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、EC肉湯、伊紅美藍瓊脂（EMB）、營養瓊脂斜面、色氨酸肉湯、MRPV培養基、Korser氏枸掾酸鹽肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液、生理鹽水、革蘭氏染色液、Kovacs氏靛基質試劑、甲基紅指示劑、Vogespros kauer（VP）試劑、4 樣品制備 以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內。如有包裝，則用75％乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。 制備樣品勻液以無菌操作取25g樣品，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質杯內，于8000r/min均質12min，制成1：10的樣品勻液。如樣品均質時間超過2min，應在均質杯外加冰水冷卻。 稀釋樣品勻液用10ml滅菌吸管準確吸取1：10的樣品勻液10ml，放入裝有90ml稀釋劑的150ml 稀釋瓶中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品勻液。5 大腸菌群的測定 大腸菌群MPN值的測定 對每個樣品，選擇適宜的三個連續稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯，每管接種1ml。 將接種管置于36177。1℃的培養48177。2h。 觀察試管的產氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產生，記錄在24h和48h內產氣的LST肉湯管數。如所有LST肉湯管均未產氣，則可報告為大腸菌群陰性；如有產氣者，則進一步作證實試驗。 大腸菌群的證實試驗 將所有產氣管用直徑為3mm的接種環移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。 置BGLB肉湯管于36177。1℃的培養48177。2h。 記錄所有BGLB肉湯管的產氣管數。 結果報告：按BGLB肉湯產氣管數，查MPN表報告每克（毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。6 糞大腸菌群測定 用接種環將所有48177。2h內產氣的LST肉湯管培養物移種于EC肉湯管中。 177。℃水浴箱內，培養24177。2h。水浴箱的水平面應高于肉湯培養基液面。℃℃不產氣的產氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性對照。 記錄EC肉湯管的產氣情況。產氣管為糞大腸菌群試驗陽性；不產氣管為糞大腸菌群試驗陰性。 結果報告：按產氣管數，查MPN表報告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值。7 大腸桿菌測定 （EMB）平板，36177。1℃的培養24177。2h。 檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。 如有典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養瓊脂斜面上，36177。1℃的培養1824h。 將斜面培養物移種到下列培養基進行生化試驗。 色氨酸肉湯：在36177。1℃的培養24177。2h后，上層出現紅色為靛基質陽性反應。 MRVP培養基：在36177。1℃的培養48177。2h后。以無菌操作移取培養物1ml至13mm*100mm試管中，加5％，40％，振搖試管后靜置2h，如出現伊紅色，為VP試驗陽性。　　將 MRVP培養物的剩余部分再培養48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養物變紅色，為甲基紅試驗陽性，若變黃色則為陰性反應。 Korser氏枸掾酸鹽肉湯：于36177。1℃的培養96h記錄有無生長。 LST肉湯：于36177。1℃的培養48177。2h，觀察試管中是否產氣。 革蘭氏染色：取18h營養瓊脂斜面培養物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。 大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下靛基質MRVP枸掾酸鹽鑒定（型別）+++典型大腸桿菌非典型大腸桿菌+++++典型中間型非典型中間型+++++典型產氣腸桿菌非典型產氣腸桿菌如出現上表以外的生化反應類型，表明培養物可能不純，應重新劃線分離，必要時做重復試驗。 結果報告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，發酵乳糖產酸產氣，IMViC試驗為++或+，再根據LST肉湯陽性管數查MPN表，報告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。注：本文參照SN016992《出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》（六）沙門氏菌檢驗1 主題內容與適用范圍本文規定了食品中沙門氏菌的檢驗方法。本文適用于航空食品的檢驗。2 設備和材料吸管（1ml、10ml）、恒溫培養箱（36177。1℃、42℃）、冰箱、均質器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡、接種棒等3 培養基和試劑緩沖蛋白胨水（BP）、氯化鎂孔雀綠增菌液、四硫酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、DHL瓊脂、HE瓊脂、WS瓊脂、SS瓊脂、三糖鐵瓊脂、蛋白胨水、靛基質試劑、尿素瓊脂()、氰化鉀(KCN)培養基、氨基酸脫羧酶試驗培養基、糖發酵管、ONPG培養基、半固體瓊脂、丙二酸鈉培養基、沙門氏菌因子血清：按26種用于初步分型；57種用于進一步分型；163種用于詳細分型。4 檢驗程序檢樣25g+225mlBP胨水沙門氏菌檢驗程序如下： 　　　 36177。1℃ 4h10ml勻液+SC100ml10ml勻液+MM(或TTB)100ml　　　　　　　　　42℃ 1824h　　　　　　36177。1℃ 1824hDHLBS36177。1℃ 4048h　　　　　　　　36177。1℃ 1824h挑取可疑菌落TSI（斜面、底層、產氣、H2S），蛋白胨水（），尿素（），KCN, 賴氨酸非如左述的各種反應結果H2S 　靛基質尿素　KCN　賴氨酸+/H2S +　靛基質+尿素　KCN　賴氨酸+H2S +　靛基質尿素　KCN　賴氨酸+ONPG甘露醇、山梨醇非沙門氏菌沙門氏菌血清學試驗沙門氏菌血清學試驗非沙門氏菌報告5 操作步驟 前增菌取檢樣25g，加入225mL緩沖蛋白胨水于均質杯內。用均質器以8000～10000r/min打碎1min，于36177。1℃培養4h(干蛋品培養18～24h)，移取10mL，轉種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）或四硫酸鈉煌綠（TTB）增菌液內，于42℃培養18～24h。同時，另取10mL，轉種于100mL亞硒酸鹽骯氨酸（SC）增菌液內，于36177。1℃培養18～24h。 分離取增菌液1環，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂平板和一個DHL瓊脂平板。兩種增菌液可同時劃線接種在同一個平板上。于36177。1℃分別培養18～24h(DHL)或40～48h(BS)，觀察各個平板上生長的菌落，沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙門氏菌Ⅲ在各個平板上的菌落特征見表1。　　表1　沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙門氏菌Ⅲ（即亞利桑那菌）BS瓊脂產硫化氫菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養基可呈黑色或棕色；有些菌株不產硫化氫，形成灰綠色的菌落周圍培養基不變黑色有金屬光澤DHL瓊脂無色半透明；產硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色 生化試驗 自選擇性瓊脂平板上直接挑取數個可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂。在三糖鐵瓊脂內，腸桿菌科常見屬種的反應結果見表2。表2　腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內的反應結果斜面底層產氣硫化氫可能的菌屬和種++/+沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌+++/+沙門氏菌Ⅲ、弗勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌++沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬+傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬+++/大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌說明：在三糖鐵瓊脂內只有斜面產酸并同時硫化氫(H2S)陰性的菌株可以排除，其他的反應結果均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能。 在接種三糖鐵瓊脂的同時，再接種蛋白陳水(供做靛基質試驗)、尿素瓊脂()、氰化鉀(KCN