生物化學(xué)維生素與輔酶章節(jié)考點(diǎn)總結(jié)-資料下載頁(yè)

【導(dǎo)讀】數(shù)由食物供給，人體自身不能合成它們。水溶性：B1、B2、B6、B12、C等，輔酶。β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、黃玉米色素在肝臟、腸粘膜內(nèi)轉(zhuǎn)化成A。維生素A，每日補(bǔ)充量1mg。有兩種：D3，D2。魚(yú)肝油、蛋黃、牛奶、肝、腎、皮膚組織等富含維生素D。調(diào)節(jié)鈣磷代謝，維持血中鈣磷正常水平，促進(jìn)骨骼正常生長(zhǎng)。活性形式：1，25一二羥基膽鈣固醇。化學(xué)名稱：生育酚，共有8種，直接具有活性。動(dòng)、植物油、麥胚油、玉米油、花生油、棉子油、蛋黃、牛奶、水果等。可保護(hù)巰基酶的活性。凝血過(guò)程中，許多凝血因子的生成與維生K有關(guān)。主要是B族維生素，絕大多數(shù)都是輔酶。TPP是催化丙酮酸、α-酮戊二酸脫羧反應(yīng)的輔酶。脂酰基載體，乙酰輔酶A是糖代謝、脂肪代謝氨基酸代謝的樞紐。

　　

【正文】 若要全部復(fù)性， Cot=104 t= 秒 B． 106 堿基對(duì) 圖上查出 Cot1/2=10 若濃度 Co= umol/L 則復(fù)性 50%所需時(shí)間 t=107 秒，約 115 天。復(fù)性 100%Cot=500 t=5 108 秒， 5758 天。 對(duì)于 ， 106bp，濃度達(dá)到 umol/L 級(jí)時(shí)，濃度已很高。 復(fù)性機(jī)制： 1020bp 成、拉鏈 雜交（ DNA— DNA、 DNA— RNA） 將不同來(lái)源的 DNA 混合加熱，變性后，慢慢冷卻使它復(fù)性。若這些異源 DNA 之間，在某些區(qū)域有相同的序列，則復(fù)性時(shí)會(huì)形成雜交分子。 第五節(jié) 核酸研究技術(shù) 一、 核酸的分離純化 要求：盡可能保持其天然狀態(tài)。 條件溫和，防止過(guò)酸、過(guò)堿。 避免劇烈攪拌，抑制核酸酶。 DNA 分離純化 真核 DNA以核蛋白（ DNP）形式存在， DNP 溶于水或鹽（ 1mol/L），但不溶于 Nacl中，利用此性質(zhì)，可將 DNP 與 RNA核蛋白分開(kāi)，提取出 DNP。 DNA核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。 RNA 的制備（重點(diǎn)介紹 mRNA 的分離、純化） 用 ，上清中即為 RNA核蛋白（ RNP）。 去蛋白：鹽酸胍、苯酚等 必須防止 RNA酶對(duì) RNA的 破壞。 二、 核酸的凝膠電泳 瓊脂糖電泳 ① 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對(duì)數(shù)成反比 ② 凝膠濃度 ③ DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。 ④ 電流，不大于 5V/cm PAGE 電泳 三、 限制性核酸內(nèi)切酶（ 1979 年發(fā)現(xiàn)） 限制修飾系統(tǒng) 圖 II 型核酸內(nèi)切酶 核酸內(nèi)切酶有 I、 II、 III 三種類型，其中 II 型酶在 DNA克隆中十分有用。 II 型酶的特點(diǎn)：限制和修飾活性分開(kāi)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子 Mg2+，位點(diǎn)序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（反向重復(fù)）。 II 型酶的切割頻率 識(shí)別位點(diǎn) 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536 Not I GCGGCCGC 限制酶的命名： 第一位： 屬名 E（大寫(xiě)） 第二、三位： 種名的頭兩個(gè)字母小寫(xiě) co 第四位： 菌株 R 第五位： 羅馬字，從該細(xì)菌中分離出來(lái)的這一類酶的編號(hào)。 同裂酶：來(lái)源不同的限制酶（名稱自然不同），識(shí)別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。 BamH： GGATCC 同裂酶 BstI 識(shí)別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。 同尾酶：來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。 BamHI： GGATCC 同裂酶： BstI GGATCC 同尾酶： BclI TGATCA BglII AGATCT MboI GATC Sau3A GATC 星號(hào)活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性 pH，或 50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識(shí)別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會(huì)發(fā)生變化。 例如 HindIII AAGCTT 四、 DNA 物理圖譜及構(gòu)建 （限制酶切圖譜、 DNA酶切位點(diǎn)圖譜） 在研究某一種 DNA 時(shí)，弄清該 DNA 分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此 DNA的基礎(chǔ)，末端標(biāo)記法構(gòu)建 DNA物理圖譜： （ 1）單酶完全降解和部分降解 （ 2）雙酶降解 圖 五、 分子雜交 Southern Blotting P353 圖 523 DNA 樣品 酶切 電泳 變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影 變性（ NaOH ） 轉(zhuǎn)膜（ NC 膜） 固定（ 80℃， 46h） 雜交（高鹽濃度， 68℃，幾小時(shí)） Southern Blotting可用于 DNA之間同源性分析，確定特異性 DNA序列的大小和定位。 可用 DNA或 RNA探針。 Northern Blotting 研究對(duì)象是 mRNA 檢測(cè)可與探針 DNA 同源雜交的 mRNA 分子的存在，因而可以研究細(xì)胞內(nèi)特定 mRNA的產(chǎn)生，即特定基因的表達(dá)。 mRNA易形成局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，總 RNA或 mRNA需在變性條件下電泳，乙二醛、甲醛可防止 RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 Western Blotting 是研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。 六、 DNA 序列分析 （一） 化學(xué)裂解法（ MaxamGilbert 法） DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定原理： 利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一標(biāo)記末端，而另一端是長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的片段群，然后將此片段群在能夠分辨長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸 DNA片段的 PAGE 上分離。 一定濃度的特測(cè)片段 32PGCTACGTA 特異性化學(xué)裂解 在 A處： 32PGCT 和 32PGCTACGT 在 G 處： 32pGCTA 在 C 處： 32PG 和 32PGCTA 在 T 處： 32PGC 和 32PGCTACG 圖 硫酸二甲酯特異切割： G 甲酸特異切割： G 和 A 肼在 Nacl條件下切割： C 肼在無(wú) Nacl條件下切割： T 和 C 32P *ACTTCGACAA 硫酸二甲酯： *ACTTC 甲酸： *P *ACTTC *ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA 肼 （有 Nacl）： *A *ACTT *ACTTCGA 肼（無(wú) Nacl）： *A *AC *ACT *ACTT *ACTTCGA 從下往上讀： CTACGTA 末端 G 不能讀出。 （二） 雙脫氧終止法 英國(guó) Sanger 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu) 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 1980 設(shè)計(jì)出 DNA測(cè)序法 1980 再獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 合成一段與待測(cè) DNA序列互 補(bǔ)的 DNA片段群。 圖 胰島素的基因工程： A鏈 63 個(gè)核苷酸 B 鏈 90 個(gè)核苷酸 （三） 序列分析儀 四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的 ddNTP 七、 DNA 合成（合成探針、引物、基因） 化學(xué)合成 —— DNA 合成儀 DNA固相合成（亞磷酸三酯法） 合成方向： 3’ 5’端 5’OH 用二對(duì)甲氧三苯甲基（ DMT）保護(hù)， 堿基上氨基用苯甲酸保護(hù) 3’OH 用氨基磷酸化合物活化 P353 合成過(guò)程 保護(hù)： 5’OH、活化 3’OH、保護(hù) 所有 NH2 DNA 的酶合成 —— PCR 用 DNA聚合酶 I 必備條件： ①模板 DNA（單鏈） ②引物 ③ DNA聚合酶 ④ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP ⑤一定濃度的 Mg2+ 鏈合成方向： 5 ’ 3’端 新的 DNA鏈合成，從引物 DNA的 3’OH 開(kāi)始。 圖 鏈的增長(zhǎng)反應(yīng)是引物 DNA的 3’OH，對(duì)脫氧核糖核苷三磷酸的α 磷原子親核進(jìn)攻的結(jié)果。 化學(xué)合成：方向 3’ 5’，不需 DNA模板，不用酶。 生物合成：方向 5’ 3’，需模板，引物，用酶。 計(jì)劃： 6