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【正文】 4204294949494941101801802004204204204204301000100020004100—— 注1：本表采用3個稀釋度〔（）、()〕〕,每個稀釋度接種3管 注2：表內所列檢樣量如改用1g(或1ml)、()()時，表內數字應相應降低10倍；()、()、()時，則表內數字相應增高10倍，其余類推。 沙門氏菌檢驗 1. 范圍 本標準規定了食品中沙門氏菌的檢驗方法。 本標準適用于各類食品和食物中毒樣品中沙門氏菌的檢驗。 2設備和材料 除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下。 2. 1 冰箱:2℃~5℃ 2. 2 恒溫培養箱:36℃士1℃,42℃士1℃ 2. 3 均質器。 2. 4 振蕩器。 2. 5 電子天平。感量0. 1 g 2. 6 無菌錐形瓶:容量500 ml,250 ml 2. 7 無菌吸管:1 ml(具0. 0lml，刻度),10 ml()或微量移液器及吸頭。 2. 8 無菌培養皿:直徑90 mm 2. 9 無菌試管:3 mmX50 mm,10 mmX75 mm 2. 10 無菌毛細管。 2. 1 1 p H計或PH比色管或精密pH試紙。 2. 12全自動微生物鑒定系統(VITEK)1) 3 培養基和試劑 3. 1 緩沖蛋白胨水(BPW):見第A. 1章。 3. 2 四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液:。 3. 3 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液:見第A. 3章。 3. 4 亞硫酸秘(BS)瓊脂:見第A. 4章。 HE(Hektoen Enteric)瓊脂:見第A. 5章。 3. 6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽XLD)瓊脂:見第A. 6章。 3. 7 科瑪嘉沙門氏菌屬顯色培養基z 3. 8 三糖鐵(TSI)瓊脂:見第A. 7章。 3. 9 蛋白胨水、靛基質試劑:見第A. 8章。 3. 10尿素瓊脂(pH7. 2:見第A. 9章。 3. 1 1 氰化鉀(KCN)培養基:。 3. 12 賴氨酸脫羧酶試驗培養基:見第A. 11章。 ⑴由法國生物梅里埃公司提供的產品的商品名。給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產品的認可。如果其他等效產品具有相同的效果，則可使用這些等效的產品。 ⑵由法國科瑪嘉公司提供的產品的商品名。給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產品的認可。如果其他等效產品具有相同的效果，則可使用這些等效的產品。 GB/T －2008 3. 13 糖發酵管:見第A. 12章。 3. 14 鄰硝基酚β－D半乳糖昔(ONPG)培養基:見第A. 13章。 3. 15 半固體瓊脂:見第A. 1 4章。 3. 16 丙二酸鈉培養基:見第A. 15章。 3. 17 沙門氏菌O和H診斷血清。 3. 18 API 20E生化鑒定試劑盒或VITEK GNI生化鑒定卡’。 4檢驗程序 沙門氏菌檢驗程序見圖1 檢樣25g(ml)+225mlBPW=1ml+TTP 10ml1ml+SC 10mlBSXLD(或HE、科瑪嘉顯色培養基)挑取可疑菌落TSI ，賴氨酸，營養瓊脂（NA），靛基質，尿素（PH ）,氰化鉀（KCN）商品化生化鑒定系統H2S+靛基質尿素KCN賴氨酸+H2S+靛基質+尿素KCN賴氨酸+H2S靛基質尿素KCN賴氨酸+/反應結果與左側描述不符甘露醇+、山梨醇+ONPG沙門氏菌，血清學試驗非沙門氏菌報告36℃177。1℃8h~18h42℃177。1℃18h~24H36℃177。1℃18h~24H36℃177。1℃18h~24H36℃177。1℃40H~48H 5操作步驟 5. 1前增菌 稱取25 g(ml)樣品放人盛有225 ml BPW的無菌均質杯中，以8 000 r/min^10 000 r/min均質 1 min^－2 min，或置于盛有225 m工JBPW的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min^}2 min。若樣品 為液態，不需要均質，振蕩混勻。如需要，測定pH值，用1 mol/ml無菌氫氧化鈉或鹽酸調pH至 6. 。無菌操作將樣品轉至500 ml錐形瓶中，如使用均質袋，可直接進行培養，于36℃士1℃培養8h~18 h 如為冷凍產品，應在45℃以下不超過15 min，或2℃ ^}5℃不超過18 h解凍。 5. 2增菌 輕輕搖動培養過的樣品混合物,移取1 ml，轉種于10 ml TTB內，于42℃士1℃培18 h~24 h 同時，另取1 ml，轉種于10 ml SC內，于36℃士1℃培養18 h ~24 h. 5. 3分離 分別用接種環取增菌液1環，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板(或HE瓊脂平 板或科瑪嘉顯色培養基平板)。于36℃士1℃分別培養18 h~24 h (XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、科瑪嘉顯色培養基平板)或40 h~48 h (BS瓊脂平板)，觀察各個平板上生長的菌落，各個平板上的菌落特 表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征 選擇性瓊脂平板 沙門氏菌 BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養基可呈黑色或棕色。有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養基不變 HE瓊脂藍綠色或藍色，多數菌落中心黑色或幾乎全黑色。有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色 XLD瓊脂 菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現大的帶光澤的黑色中心，或呈現全部黑色的菌落。有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心 科瑪嘉顯色培養基菌落為紫紅色 5. 4. 1自選擇性瓊脂平板上分別挑取兩個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于 底層穿刺。接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫梭酶試驗培養基和營養瓊脂平板，于36℃士1℃培養 18 h~24 h，必要時可延長至48 h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫梭酶試驗培養基內，沙門氏菌屬的反應 結果見表20 表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫梭酶試驗培養基內的反應結果 三糖鐵瓊脂賴氨酸脫梭酶試驗培養基初步判斷斜面底層產氣硫化氫—++(一)+(一)+可疑沙門氏菌屬—++(一)+(一)_可疑沙門氏菌屬+++(一)+(一)+可疑沙門氏菌屬+++/一+/一_非沙門氏菌注:+陽性，一陰性。+(一)多數陽性，少數陰性。+/一陽性或陰性。 GB/T －2008 表2說明，在三糖鐵瓊脂內斜面產酸，底層產酸，同時賴氨酸脫梭酶試驗陰性的菌株可以排除。 其他的反應結果均有沙門氏菌屬的可能，同時也均有不是沙門氏菌屬的可能。 5. 4. 2接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗培養基的同時，可直接接種蛋白陳水(供做靛基質試驗)、尿素瓊脂(pH7. 2) ,氰化鉀(KCN)培養基，也可在初步判斷結果后從營養瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于3 6 ℃ 177。1℃培養18 h~24 h，必要時可延長至48 h，按表3判定結果。將已挑菌落的平板儲存 于2℃177。5℃或室溫至少保留24 h，以備必要時復查。 表3沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表反應序號硫化氫(H, S)靛基質pH7. 2尿素氰化鉀KCN賴氨酸脫羧酶A1+－－－+A2++－－+A3－－－+/－注：+陽性；－陰性；+（－）陽性或陰性 反應序號A1典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素。氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常。按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌 表4 沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表pH7. 2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結果 — — —甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學鑒定結果） — + +沙門氏菌IV或V（要求符合本群生化特性） + — +沙門氏菌個別變體（要求血清學鑒定結果） +表示陽性，—表示陰性。 5. 4. 2. 2 反應序號A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質陽性變體兩項試驗結果均為陽性，但需要結合血清學鑒定結果進行判定。 5. 4. 2. 3反應序號A3：補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。 5. 4. 2. 4必要時按表5進行沙門氏菌生化群的鑒別。 表5 沙門氏菌屬各生化群的鑒別項目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛矛醇++——+—山梨醇+++++—水楊苷———+——ONPG——+—+—丙二酸鹽—++———氰化鉀（KCN）———++— 注：+表示陽性—表示陰性。 5. 4. 3如選擇API 20E生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統，可根據5. 4. 1的初步判斷 結果，從營養瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當的菌懸液，使用API 20E生化鑒定 試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統進行鑒定。 GIi/T －2008食品中乳酸菌檢驗1 范圍 本標準規定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的檢驗方法。 本標準適用于含活性乳酸菌的固體、半固體和液體食品中乳酸菌的檢驗。2 規范性引用文件 下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。 GB/ 食品衛生微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗3 術語和定義 下列術語和定義適用于本標準。 乳酸菌 lactic acid bacteria 一類可發酵糖主要產生大量乳酸的細菌的通稱。與食品工業密切相關的乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus）中的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等。4 設備和材料 除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下。 恒溫培養箱：36℃177。1℃。 冰箱：2℃～5℃。 均質器及無菌均質袋、均質杯或滅菌乳體。 天平：。 無菌試管：18mm180mm、15mm100mm 。 無菌吸管：1mL（）、10mL（）或微量移液器及吸頭。 無菌錐形瓶：500mL、250mL、5 培養基和試劑 API 50CH生化鑒定試劑盒①。 MRS（man rogosa sharpe）培養基：。 MC（modified chalmers）培養基：。 %蔗糖發酵管：。 %纖維二糖發酵管：。 ①由法國生物梅里埃公司提供的產品的商品名。給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產品的認可。如果其他等效產品具有相同的效果，則可使用這些等效的產品。 %麥芽糖發酵管：. %甘露醇發酵管：. %水楊苷發酵管：. %山梨醇發酵管：. %乳酸發酵管：. . 革蘭氏染色液:6 檢驗程序乳酸菌檢驗程序見圖1。圖 1 乳酸菌檢驗程序圖7操作步驟。℃—5℃條件下解凍，時間不超過18h，也可在溫度不超過45℃的條件下解凍，時間不超過15min。：以無菌操作稱取25g樣品，置于裝有225mL生理鹽水的無菌均質杯內，于8000r/min一10000r/min均質1min—2min，制成l:10樣品勻液；或置于裝有225mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min—2min制成1：10的樣品勻液。：液體樣品應先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25mL放人裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1：10的樣品勻液。 :10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。，選擇2個一3個連續的適宜稀釋度，使用L形棒進行表面涂布。根據樣品中所含乳酸菌的種類選擇培養基及培養條件，見表1，每一種培養條件的每個稀釋度作兩個平皿。乳酸菌在MRS和MC培養基上菌落生長形態特征見表2。從樣品稀釋到平板涂布整個試驗過程要求在20min內完成。表 1 乳酸菌計數培養基及培養條件的選擇樣品中所含菌屬 MRS瓊脂平板，36℃土l℃，48hMC瓊脂平板，36℃