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2026-06-13 21:03本頁面

　　

【正文】 10天，根據需要更換培養基－－大約每隔一天。觀察細胞形態，神經樣細胞大約出現在第4到第7天。當神經樣細胞能夠被鑒別時，轉入到第4步。步驟的轉換應該在神經前體細胞出現第一個清晰的標志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。第4步－N3培養基＋bFGF通過將神經前體細胞培養在含有10ng/ml bFGF的培養基中進行擴增。，加入12ml 胰酶2．37℃孵育5分鐘3．用4mlEB培養基終止胰酶活性，將細胞轉入錐形管中放置3～5分鐘移出細胞團，將上清移入一新的離心管離心。4．將細胞重懸于含有bFGF的N3培養基。5．將細胞接種在包被多聚L鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養板或6孔培養板，6孔培養板中每孔放置5個蓋玻片如果是塑料的放置4個，以使最大可能的獲得樣品數量）。105/106/孔。6．2天后更換培養基第5步－N3培養基通過撤除bFGF使神經前體細胞分化1．細胞被接種在蓋玻片上4天后將培養基換成不含bFGF的N3培養基2．根據需要換液（大約每隔一天）3．分化10～15天后固定細胞移除培養基PBS洗滌加入4%福爾馬林室溫放置30分鐘PBS洗滌2次儲存于PBS。％疊氮化納的PBS移植細胞的準備細胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應于體外分化過程中的第2步末細胞被轉種到組織培養板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時間以便將胚狀體移植入一10cm的培養皿。移植1．將胚狀體轉移至一15ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。細胞被離心3分鐘會更好。放置使之沉降將會去除更多的單個細胞（包括死細胞）而這些細胞可以被離心下來。2．去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1PBS中3．離心3分鐘4．去除上清加入1胰酶（10cm的培養皿加1ml）5．37℃水浴5分鐘6．加入5mlEB培養基小心吹打約10次小心處理細胞很重要，進行細胞傳代分散細胞時不可劇烈吹打。7．離心2分鐘8．吸出上清將細胞重懸于500μl EB培養基9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次10．離心2次11．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養基煙酸己可堿標記ES細胞進行移植1．準備一10μg/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）2．加入1mg（你能稱到的最小量）到5ml EB培養基（制成200μg/ml）3．將溶液稀釋成10μg/ml （100μl 200μg/ml EB培養基）4．如前所述將細胞重懸于2ml煙酸已可堿染液而不是EB培養基中制備ES細胞懸液，5．將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘6．離心2分鐘7．吸出上清將細胞重懸于2ml EB培養基8．重復一次9．離心2分鐘10．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養基并置于冰上。 6

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