細(xì)胞生物學(xué)研究方法(專業(yè)版)

　　

【正文】 物理法 ：用機(jī)械方法或短波光把細(xì)胞核去掉或失 活 ， 然后用微吸管吸取其它細(xì)胞的核 ， 注入去核的細(xì)胞質(zhì)中 ， 組成新的雜交細(xì)胞 。 細(xì) 胞 融 合 同核融合細(xì)胞 ： 基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱為同核體 (homokaryon)； 異核融合細(xì)胞 ： 來自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體 (heterokaryon)。 是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。 核酸雜交原理 原位雜交 (in situ hybridization)： 在不破壞細(xì)胞或細(xì)胞器的情況下，用核酸探針檢測特定核苷酸序列在染色體上的精確位置的技術(shù)，稱為原位雜交(in situ hybridization)。 常用的螢光素有異硫氰酸熒光素 (FITC)、 羅丹明 (rhodamine)等 。 密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體 CsCl 密度梯度離心分離 DNA 密度大于 ? 原理： 利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征 ， 通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量 。如果探針距離物體表面很近 —— 大約在納米級的距離上電子會(huì)穿過物體與探針之間的空隙，形成一股微弱的電流。 標(biāo)本在熒光屏上呈黑白反差的結(jié)構(gòu)影像。 微分干涉顯微鏡還可用于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。 什么是熒光？ 當(dāng)一個(gè)物體吸收了紫外光（短波光）的能量，物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出比原來吸收的波長更長的光為“熒光”。 顯微鏡適合的放大倍數(shù) 放大倍數(shù) ：是眼睛看到像的大小與對應(yīng)標(biāo)本長度大小的比值。 / Alexey Khodjakov, 紐約健康部門 Wadsworth 中心。 實(shí)際情況下 ， 電鏡的實(shí)際分辨率常常受到生物制樣技術(shù)本身的限制 ， 如在超薄切片樣品中其分辨率約為超薄切片厚度的 1/10， 即通常切片厚度若是 50nm， 其實(shí)際分辨率約為 5nm， 遠(yuǎn)低于電鏡的分辨本領(lǐng) 。 冰凍蝕刻技術(shù)的操作步驟 : ② 然后用冷刀驟然將標(biāo)本沖斷開 ， 升溫后冰在真空條件下迅即升華 ， 細(xì)胞內(nèi)外凡含水多的地方因失水而下陷 ,暴露出了斷裂面的 膜和其它一些結(jié)構(gòu) ,增強(qiáng)了斷面的浮雕效果－蝕刻 。 這些特點(diǎn)適用于研究觀察生物大分子 (如 DNA、 RNA和蛋白質(zhì)等 )的原子布陣和一些生物結(jié)構(gòu) (如生物膜 、 細(xì)胞壁等 )的原子排列 ,而不需要特別的制樣技術(shù) ，并且探測過程對樣品無損傷 —— 納米科學(xué)水平 。 Feulgen反應(yīng) 糖類顯示方法 －－－ 過碘酸雪夫反應(yīng)（ periodic acid Schiff reaction,PAS反應(yīng)） 基本原理 ： 過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變?yōu)橐叶┗笳呃^而與Schiff試劑（無色亞硫酸品紅復(fù)合物）結(jié)合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。 主要步驟： 炭疽桿菌 24h培養(yǎng)物直接熒光抗體檢測 間接熒光抗體檢測細(xì)胞培養(yǎng)中的豬瘟病毒 免疫膠體金標(biāo)記抗體 膠體金是利用還原劑將氯化金分子聚合成具有特定大小的顆粒結(jié)構(gòu) ，1970年引入免疫電鏡技術(shù) 。 這種 利用放射性物質(zhì)使照相乳膠膜產(chǎn)生該物質(zhì)自身影像的技術(shù) ， 稱為放射自顯影術(shù) 。 細(xì)胞株 (Cell Strain) ： 細(xì)胞系（ Cell Line）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系（ Lineage of Cells）所組成。 ２ .化學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞融合（如 PEG） 細(xì)胞融合不僅可用于基礎(chǔ)研究 ， 而且還有重要的應(yīng)用價(jià)值 ， 如動(dòng)植物育種和制取單克隆抗體 等 。 顯微操作技術(shù) micromanipulation technique ? 在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法 。 如細(xì)胞含有此兩種酶則可啟動(dòng)補(bǔ)救途徑。 接觸抑制和密度依賴性 實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系 細(xì)胞系名稱 細(xì)胞類型 來源 3T3 胚胎成纖維細(xì)胞 小鼠 HeLa 宮頸癌上皮細(xì)胞 Henrietta Lacks BHK21 成纖維細(xì)胞 敘利亞倉鼠 PtKl 上皮細(xì)胞 袋鼠 L6 成肌細(xì)胞 大鼠 PCI2 嗜鉻細(xì)胞 大鼠 SP2 漿細(xì)胞 小鼠 SP2／ 0 骨髓瘤漿細(xì)胞 小鼠 CHO 卵巢細(xì)胞 中國地鼠 Hela細(xì)胞（左）、 CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng) 正常 細(xì)胞培養(yǎng) 的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去。 前者是利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對紫外光某波段特有的吸收曲線來 檢定相應(yīng)物質(zhì)的含量 ；后者則是根據(jù)某種 物質(zhì)特異的染色反應(yīng) ， 然后再測定其對可見光某特定波段的吸收能力來進(jìn)行對該物質(zhì)的定量測定 。 這稱為間接免疫法 。 2． 脂類顯示方法 二十世紀(jì) 70年代以來，免疫學(xué)的迅速發(fā)展為細(xì)胞生物學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的手段，特別是在細(xì)胞內(nèi)特異蛋白的定位與定性方面，單克隆抗體與其它一些檢測手段相結(jié)合發(fā)揮了重要作用。 收集沉淀 ， 改用較高的離心速度離心懸浮液 ， 將較小的顆粒沉降 ， 以此類推 ， 達(dá)到分離不同大小顆粒的目的 。 復(fù)膜 細(xì)胞冰凍斷裂后的電鏡圖像 ? 20世紀(jì) 60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。 切片 :將樣品制成 50～100nm厚的薄片。 （四）相差顯微鏡 用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本 相差顯微鏡觀察的活細(xì)胞 （五）微分干涉差顯微鏡 ? 在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明 ? 其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像 。嗜堿性結(jié)構(gòu)通常包括含有 核酸 的部分，如核糖體、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中富含核糖核酸（ RNA）的區(qū)域等。染料 蘇木精可以將 嗜堿 性結(jié)構(gòu)染成 藍(lán)紫色 ，而 伊紅 可以將 嗜酸 性結(jié)構(gòu)染成 粉紅色 。 把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差 ， 從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度 ， 使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見 。 包埋 :為制成超薄切片 ,并使切片耐受高真空、電子轟擊 , 切片前需包埋 ,常用環(huán)氧樹脂。 電鏡下的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu) 。 起始的離心速度較低 ， 讓較大的顆粒沉降到管底 ， 小的顆粒仍然懸浮在上清液中 。也可用四氧化鋨（ OSO4）染色，脂肪酸或膽堿可使 OSO4還原為 OSO2而呈黑色。 的另一抗體 （ 第二抗體 ） 把標(biāo)記物 （ 膠體金 ） 引入同一部位 。 細(xì)胞顯微分光光度測定法可分為 紫外光顯微分光光度測定法 與 可見光顯微分光光度測定法 。（非正常細(xì)胞如癌細(xì)胞除外）。 可被氨基喋呤 阻斷 輔助途徑：是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng) 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（ HGPRT） 和胸腺嘧啶核苷激酶（ TK） 的催化作用合成 DNA。 顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置 。 A 低 產(chǎn)