細胞生物學研究方法(留存版)

　　

【正文】 抗倒伏 B 高 產 易倒伏 AB 雜交細胞 高產 抗倒伏 細胞 融合 (雜交 ) ? 在生命科學中應用價值極大的單克隆抗體的制備技術就是在細胞融合技術上發展起來的．單克隆抗體的誕生，導致了免疫學技術的革命．這項技術或１９８４年諾貝爾醫學及生理學獎． 應用： ?疾病的論斷和治療 (生物導彈 ) ?生物大分子的鑒定、定位和分離純化 ?細胞器的鑒定、定位和分離 ?特定細胞或病毒的鑒定、定位和分離 二 單克隆抗體技術 榮獲 1984年諾貝爾生理學或醫學獎 發明單克隆抗體技術 杰尼 Niels K. Jerne 丹麥 巴塞爾免疫研究所 1911年 1994年 科勒 Gees . K246。 如果傳代培養不超過 10左右，稱為有限細胞系（ finite cell line）。 五、放射自顯影術 六 定量細胞化學分析技術 前面介紹了細胞內不同成分的細胞化學定性與定位方法，然而蛋白或核酸等生物大分子在某個細胞中或細胞群體中的含量分析對了解該物質的生物學功能是十分重要的。 由于膠體金顆?？梢灾瞥深A定的大小 ， 形態規則 ，電子密度高 ， 對細胞無毒性等優點 ， 故是當今最為廣泛的標記物 。 酶組織化學染色法 基本原理： 是利用酶對其相應底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反應產物與某種試劑發生反應，形成 沉淀 或 有色的最終產物，借此檢測該酶在組織切片或細胞內的分布及活性強弱。 掃描隧道顯微鏡的優越之處： 第二節 細胞組分的分析方法 一、用超離心技術分離細胞器與生物大分子及其 b 復合物 二、細胞內核酸、蛋白質、 酶、糖與脂類等的顯 b 示方法 三、特異蛋白抗原的定位與定性 四、細胞內特異核酸的定位與定性 一、用超離心技術分離細胞器與生物大分子及其合物 各種離心技術 —— 離心是研究亞細胞成分和生物大分子的基本手段。 ③ 標本蝕刻后， 再向斷裂上以 45176。 由于電子束穿透力很弱，因此用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅 20－ 50nm 的超薄切片，并放在銅網上。 放大 1600倍的人類精子細胞 （三）激光共聚焦掃描顯微 鏡 是在熒光顯微鏡成像的基礎上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發出熒光，利用計算機進行圖像處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像的一種光學顯微鏡。 放大倍數 ＝ 目鏡 的放大倍數 X物鏡 的放大倍數 人眼的分辨能力在 mm左右 ① 固定： 可使生物大分子交聯，蛋白質成分凝固，防止細胞自溶和破壞而產生人工假象。 誘發熒光 :一些細胞成分本身經紫外線照射后不發熒光，但用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖叮橙等熒光色素）進行活體染色或固定后切片染色，就能在熒光鏡下看見熒光，這種熒光叫誘發熒光。目前像基因注入、核移植等生物工程的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。 分辨率 。 掃描隧道顯微鏡原理 示意圖 探針和物體之間加上電壓。 ?常用介質： 氯化銫 、 蔗糖 、 多聚蔗糖 。 ?間接法 ?直接法 將帶有標記的抗體與抗原反應 ，顯示出抗原存在的部位 在抗體抗原初級反應的基礎上 ， 再用帶標記的次級抗體與初級抗體反應 ， 從而使初級反應得到放大 ， 增強顯示效果 Antigen presenting Cell Enzymeconjugated Primary Antibody Substratechromogen solution ?直接法 將帶有標記的抗體與抗原反應 ，顯示出抗原存在的部位 間接免疫細胞化學法的原理示意圖 次級 抗體 初級 抗體 標記物 第一抗體（一抗） 第二抗體（二抗） Primary Antibody Enzymeconjugated Secondary Antibody Antigen presenting Cell Substratechromogen solution 間接法 （一）免疫熒光技術 免疫熒光技術 就是將免疫學方法 （ 抗原抗體特異結合 ） 與熒光標記技術相結合用來研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法 。 （ 2）免疫電鏡技術 體外培養的 BHK21細胞經選擇性抽提后用抗 280kD核骨架蛋白抗體進行免疫膠體金標記的結果 IF： 中間纖維； g： 金顆粒； N： 核區。 一 細 胞 培 養 （一） 動物細胞培養 （二） 植物細胞培養 第三節 細胞培養 、 細胞工程與顯微操作技術 細胞培養 就是將動植物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞或直接以單細胞 生物，給予必要的生長條件，讓其在培養瓶中或培養基上繼續生長與增殖。 （一） 細胞融合的概念 細胞融合（ cell fusion）又稱細胞雜交（ cell hybridization）是指在自然條件下或人工方法（物理，化學，生物等方法）將不同種生物或同種生物不同類型兩個或多個真核細胞合并成一個雙核或多核細胞的生物學現象和過程。 脾細胞 (B淋巴細胞 ) 骨髓瘤細胞 雜交瘤細胞 脾細胞 /?脾細胞 骨髓瘤細胞 / ?骨髓瘤細胞 骨髓瘤細胞 脾細胞 不能長期存活 不能長期存活 單克隆抗體制備示意圖 三 細胞拆合及顯微操作技術 細胞拆合方法： 可以分為物理法和化學法兩種類型 。 這種核移植必須用顯微操縱儀進行操作 。 兩個細胞正在融合 細胞膜的流動性是動物細胞融合的生物學基礎。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養，但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。 原位雜交技術首先是在光鏡水平上發展起來的， 放射性同位素 標記的探針與樣品中的 DNA或 RNA雜交后，用顯微放射自顯影的方法顯示雜交物的存在部位；或用 熒光素 標記的探針進行雜交，在熒光顯微鏡下直接顯示與探針雜交的核酸存在部位。 實質 就是用結合有 熒光素 的抗體與組織內抗原反應，在熒光顯微鏡下觀察抗原的存在部位。 ? 利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括糖類、脂類、核酸、酶等。如果探針與物體的距離發生變化，這股電流也會相應的改變。 電子密度高、電子密度低 ：被重金屬浸染呈黑色的結構，稱電子密度高；反之，淺染的部分稱電子密度 用 重金屬鹽 （如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品 進行 染