細胞生物學研究方法(完整版)

　　

【正文】 90 13 X 射線 13 0. 05 γ射線 1 0. 005 電子束 : 100V 0. 12 3 10 ,0 00V 0. 01 22 10 0, 000V 0. 00 387 各種光及電子束的波長 透射 電子顯微 電鏡 電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區別 顯微鏡 分辨本領 光源 透鏡 真空 成像原理 光鏡 電鏡 200nm 100nm 可見光（ 400700） 紫外光 （約200nm) 電子束 () 玻璃透鏡 玻璃透鏡 電磁透鏡 不要求真空 不要求真空 要求真空 ～ 利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化 利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差 電子顯微鏡的分辨本領與有效放大倍數 電子顯微鏡的分辨率可達 ， 其放大倍數為 100萬倍 。 把透過標本的可見光的光程差變成振幅差 ， 從而提高了各種結構間的對比度 ， 使各種結構變得清晰可見 。 染 色 不染色 激發光 發射光 熒光顯微鏡的種類 透射式 落射式 熒光顯微鏡的在生命科學中的應用： 熒光顯微鏡技術包括免疫熒光技術和熒光素直接標記技術 。染料 蘇木精可以將 嗜堿 性結構染成 藍紫色 ，而 伊紅 可以將 嗜酸 性結構染成 粉紅色 。 Chapter 3. Techniques in Cell Biology 第三章 細胞生物學研究方法 艾永興 動物生物技術系 吉林大學動物科學學院 聯系方式： 13804314800 光學顯微鏡技術（ light Microscopy） 電子顯微鏡技術 (Electro microscopy) 掃描探針顯微鏡（ Scanning Probe Microscope） 第一節 細胞形態結構的觀察方法 一 光學顯微鏡技術（ light icroscopy） 復合顯微鏡 ： 現今使用的光學顯微鏡都是由幾個透鏡組合而成，所以又稱為 復合顯微鏡。嗜堿性結構通常包括含有 核酸 的部分，如核糖體、細胞核及細胞質中富含核糖核酸（ RNA）的區域等。 熒光顯微鏡是目前在光鏡水平對特異蛋白質等生物大分子 定性定位 的最有力的工具 。 （四）相差顯微鏡 用途：觀察未經染色的玻片標本 相差顯微鏡觀察的活細胞 （五）微分干涉差顯微鏡 ? 在相差顯微鏡原理的基礎上發明 ? 其優點是能顯示結構的三維立體投影影像 。上述放大倍數稱之為有效放大倍數；如繼續通過光學手段放大也不會得到任何有意義的信息 ， 因此稱之為 “ 空放大 ” 。 切片 :將樣品制成 50～100nm厚的薄片。 冰凍斷裂技術也是研究細胞內部各種細胞器結構的有用手段 。 復膜 細胞冰凍斷裂后的電鏡圖像 ? 20世紀 60年代問世，用來觀察標本表面結構。 如 STM在平行和垂直于樣品表面方向的分辨率分別可達 ， 即可以分辨出單個原子 ， 具有原子級的分辨率 。 收集沉淀 ， 改用較高的離心速度離心懸浮液 ， 將較小的顆粒沉降 ， 以此類推 ， 達到分離不同大小顆粒的目的 。 原理 : 標本經稀鹽酸水解后， DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現了醛基。 2． 脂類顯示方法 二十世紀 70年代以來，免疫學的迅速發展為細胞生物學的研究提供了強有力的手段，特別是在細胞內特異蛋白的定位與定性方面，單克隆抗體與其它一些檢測手段相結合發揮了重要作用。 它主要包括熒光抗體的制備， 標本的處理，免疫染色和觀察記錄等過程。 這稱為間接免疫法 。 熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization,FISH): FISH技術的原理圖解 放射性同位素發射出的各種射線能使照相乳膠中的鹵化銀晶體還原 (感光 )。 前者是利用細胞內某些物質對紫外光某波段特有的吸收曲線來 檢定相應物質的含量 ；后者則是根據某種 物質特異的染色反應 ， 然后再測定其對可見光某特定波段的吸收能力來進行對該物質的定量測定 。 適應在體外培養條件下持續傳代培養的細胞稱為傳代細胞 傳代培養 ： 細胞株 :通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得具有特殊性質或標志物 的 細胞稱為細胞株。 接觸抑制和密度依賴性 實驗室中常用的幾種細胞系 細胞系名稱 細胞類型 來源 3T3 胚胎成纖維細胞 小鼠 HeLa 宮頸癌上皮細胞 Henrietta Lacks BHK21 成纖維細胞 敘利亞倉鼠 PtKl 上皮細胞 袋鼠 L6 成肌細胞 大鼠 PCI2 嗜鉻細胞 大鼠 SP2 漿細胞 小鼠 SP2／ 0 骨髓瘤漿細胞 小鼠 CHO 卵巢細胞 中國地鼠 Hela細胞（左）、 CHO細胞（右）的培養 正常 細胞培養 的世代數有限，只有癌細胞和發生轉化的細胞才能無限生長下去。 動物細胞融合的原理 細胞融合過程 細胞融合可分為４個過程： １ .細胞的接觸 ２ .細胞質膜的融合 ３ .細胞質的重組 ４ .遺傳物質的選擇 細 胞 融 合 過 程 許多病毒都具有凝集動物細胞并促使凝集的動物細胞發生融合的能力。 如細胞含有此兩種酶則可啟動補救途徑。 由于核體外表包有一層細胞膜和少量胞漿 ， 因而在 PEG或仙臺病毒的介導下 ， 核體可同另一胞質體融合 ， 形成重組細胞 。 顯微操作技術 micromanipulation technique ? 在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作的一種方法 。 T, 胸腺嘧啶 H T 外源性途徑 (旁路途徑 ) DNA 內源性途徑 (主要途徑 ) 糖和氨基酸 二氫葉酸還原酶 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) 外源性途徑 (旁路途徑 ) A A, 氨基喋呤 。 ２ .化學介導的細胞融合（如 PEG） 細胞融合不僅可用于基礎研究 ， 而且還有重要的應用價值 ， 如動植物育種和制取單克隆抗體 等 。 細 胞 工 程 (cell engineering) ? 概念 ： 是指應用現代細胞生物學、發育生物學、遺傳學和分子生物學的理論與方法，按照人們的需要和設計，在細胞水平上的遺傳操作，重組細胞的結構和內含物，以改變