細(xì)胞生物學(xué)研究方法(更新版)

　　

【正文】 生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。 細(xì)胞株 (Cell Strain) ： 細(xì)胞系（ Cell Line）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系（ Lineage of Cells）所組成。 原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá) 99%。 這種 利用放射性物質(zhì)使照相乳膠膜產(chǎn)生該物質(zhì)自身影像的技術(shù) ， 稱為放射自顯影術(shù) 。 此外 ， 在免疫電鏡技術(shù)中 ， 還必須注意盡量保存樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu) 。 主要步驟： 炭疽桿菌 24h培養(yǎng)物直接熒光抗體檢測(cè) 間接熒光抗體檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)中的豬瘟病毒 免疫膠體金標(biāo)記抗體 膠體金是利用還原劑將氯化金分子聚合成具有特定大小的顆粒結(jié)構(gòu) ，1970年引入免疫電鏡技術(shù) 。 三、特異蛋白抗原的定位與定性 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ Immunocytochemistry） 利用抗原和抗體的結(jié)合具有高敏感性和特異性的特點(diǎn)，用已知的經(jīng)過標(biāo)記的抗體檢測(cè)組織與細(xì)胞中相應(yīng)抗原的方法。 Feulgen反應(yīng) 糖類顯示方法 －－－ 過碘酸雪夫反應(yīng)（ periodic acid Schiff reaction,PAS反應(yīng)） 基本原理 ： 過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變?yōu)橐叶┗笳呃^而與Schiff試劑（無色亞硫酸品紅復(fù)合物）結(jié)合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。適用于大小、形態(tài)相似而密度不同的組分。 這些特點(diǎn)適用于研究觀察生物大分子 (如 DNA、 RNA和蛋白質(zhì)等 )的原子布陣和一些生物結(jié)構(gòu) (如生物膜 、 細(xì)胞壁等 )的原子排列 ,而不需要特別的制樣技術(shù) ，并且探測(cè)過程對(duì)樣品無損傷 —— 納米科學(xué)水平 。 （二）掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡原理 工作原理： 是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 冰凍蝕刻技術(shù)的操作步驟 : ② 然后用冷刀驟然將標(biāo)本沖斷開 ， 升溫后冰在真空條件下迅即升華 ， 細(xì)胞內(nèi)外凡含水多的地方因失水而下陷 ,暴露出了斷裂面的 膜和其它一些結(jié)構(gòu) ,增強(qiáng)了斷面的浮雕效果－蝕刻 。 常用的染色劑：醋酸鈾、枸櫞酸鉛。 實(shí)際情況下 ， 電鏡的實(shí)際分辨率常常受到生物制樣技術(shù)本身的限制 ， 如在超薄切片樣品中其分辨率約為超薄切片厚度的 1/10， 即通常切片厚度若是 50nm， 其實(shí)際分辨率約為 5nm， 遠(yuǎn)低于電鏡的分辨本領(lǐng) 。 。 / Alexey Khodjakov, 紐約健康部門 Wadsworth 中心。 正置顯微鏡 倒置顯微鏡 （二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope 概念： 是以紫外線為光源激發(fā) 生物樣品中的熒光物質(zhì) ， 產(chǎn)生 能觀察到的各種顏色熒光的一 種光學(xué)顯微鏡 。 顯微鏡適合的放大倍數(shù) 放大倍數(shù) ：是眼睛看到像的大小與對(duì)應(yīng)標(biāo)本長(zhǎng)度大小的比值。E染色 ”（ hematoxylin and eosin stain、HE stain），是組織學(xué)最常用的染色方法之一。 什么是熒光？ 當(dāng)一個(gè)物體吸收了紫外光（短波光）的能量，物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出比原來吸收的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光為“熒光”。查爾菲和錢永健。 微分干涉顯微鏡還可用于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。 1. 超薄切片技術(shù) 二、主要電鏡制樣技術(shù)： 超薄切片 銅網(wǎng) 取材 :要快，避免損傷，標(biāo)本必須薄，小 固定 :常用戊二醛和四氧化鋨固定，四氧化鋨除與蛋白共價(jià)結(jié)合外 ,還對(duì)脂類有良好的固定效果。 標(biāo)本在熒光屏上呈黑白反差的結(jié)構(gòu)影像。 噴碳后 將樣品浸泡于腐蝕液中將生物組織腐蝕掉，只剩下鉑－碳復(fù)型膜。如果探針距離物體表面很近 —— 大約在納米級(jí)的距離上電子會(huì)穿過物體與探針之間的空隙，形成一股微弱的電流。 離心機(jī)： 普通： 8000rpm以下； 高速： 8000~25000rpm； 超速： 25000rpm以上，達(dá)十幾萬 rpm。 密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體 CsCl 密度梯度離心分離 DNA 密度大于 ? 原理： 利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征 ， 通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量 。標(biāo)本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。 常用的螢光素有異硫氰酸熒光素 (FITC)、 羅丹明 (rhodamine)等 。 膠體金可以直接與抗體連接形成免疫金 ， 導(dǎo)至抗原部位 ， 稱為直接免疫法 。 核酸雜交原理 原位雜交 (in situ hybridization)： 在不破壞細(xì)胞或細(xì)胞器的情況下，用核酸探針檢測(cè)特定核苷酸序列在染色體上的精確位置的技術(shù)，稱為原位雜交(in situ hybridization)。 顯微分光光度測(cè)定技術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜 ， 核酸 (260nm)、 蛋白質(zhì) (280nm)、 細(xì)胞色素 、 維生素等都有自己特征性的吸收曲線 。 是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。 如果細(xì)胞能無限傳代培養(yǎng)，稱為永生化細(xì)胞系（ immortal cell line）。 細(xì) 胞 融 合 同核融合細(xì)胞 ： 基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱為同核體 (homokaryon)； 異核融合細(xì)胞 ： 來自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體 (heterokaryon)。sar Milstein 英國 英國醫(yī)學(xué)研究委員會(huì) 分子生物實(shí)驗(yàn)室 1927年 三 . 單克隆抗體的概念和原理 由單一克隆的 雜交瘤細(xì)胞 分泌的抗體，只針對(duì)于一個(gè)抗原決 定簇 —— 單克隆抗體 抗原分子表面具有特殊立體構(gòu)型和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)稱為抗原決定簇。 物理法 ：用機(jī)械方法或短波光把細(xì)胞核去掉或失 活 ， 然后用微吸管吸取其它細(xì)胞的核 ， 注入去核的細(xì)胞質(zhì)中 ， 組成新的雜交細(xì)胞 。 注射吸管 固定吸管 DNA 思考題： 1. 如何分離分析細(xì)胞組分？ 2. 什么是原位雜交？ 3. 單克隆抗體技術(shù)原理？ 4. 原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、 5. 細(xì)胞系、細(xì)胞株、細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）