香菇多糖抗氧化增效劑的研究畢業論文(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 0冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司868型pH計上海奧立龍電器有限公司RE6000旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠SHZIII型循環水真空泵上海亞榮生化儀器廠GBOF20CN1LDG(WO)型微波爐Galanz有限公司TGL16M高速臺式冷凍離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司 方法 多糖、多肽、皂苷等活性物質的提取及制備 香菇多糖提取（超聲波協同復合酶法） 新鮮香菇切碎，在60℃下干燥至恒重， 粉碎后過60目篩。，按料液比1：20加蒸餾水。超聲提取溫度60℃，時間40min。稱取適量復合酶（木瓜蛋白酶：纖維素酶=2：1），加入5mL蒸餾水溶解。香菇溶液預熱至55℃，加入酶液，恒溫振蕩。反應結束后過濾，將濾液滅酶10min。冷卻至室溫后4000r/min離心，取上清液，醇沉，離心后取沉淀物。冷凍干燥得香菇多糖粉末，低溫保藏。 大棗多糖提取（微波輔助法） 干大棗切碎，在60℃鼓風干燥箱中干燥至恒重， 粉碎后過60目篩。，以1: 30的料液比加蒸餾水水浸80分鐘，微波400w加熱4分鐘，冷卻，靜置。4000r/min離心10分鐘，取上清液，醇沉，離心，取沉淀物。冷凍干燥得大棗多糖粉末，低溫保藏待用。 三七皂苷粗提物提取（醇提法） 將三七放置在燒杯中，用蒸餾水浸泡48小時，粉碎成細小塊狀，過濾，濾渣放置烘箱中烘干，將濾液蒸發濃縮。，加20mL 60%的乙醇連續浸提兩次，過濾，除去濾渣。合并提取液，在50℃下蒸發濃縮。濃縮液干燥至恒重，密封保存備用。 大豆多肽的制備（堿溶酸沉協同酶解法） ，按料液比1: 10加入蒸餾水，水浴50℃振蕩30min，冷卻，離心。取沉淀物按照上述方法重復處理，將兩次上清液合并，靜置20min。離心后所得沉淀物即為大豆蛋白。真空冷凍干燥，低溫保存。采用考馬斯亮藍法測蛋白含量[25] 測得濃度為34μg/mL，取料液比1: 30，溫度60℃，%的木瓜蛋白酶水解2h，100℃，5min 終止水解。5000r/min離心，取上清液，冷凍干燥備用。 四種提取物含量測定 多糖含量測定香菇多糖及大棗多糖提取液經淀粉KI試驗無顏色變化，采用硫酸苯酚法[26] 測定其多糖含量。 皂苷含量測定 比色法測定總皂苷含量[27]。標準曲線的繪制：準確稱取5mg人參皂苷對照品，加乙醇定容至5mL，配置成1mg/mL皂苷溶液。分別吸取60、80、100、11160、180μL標準液于具塞試管中，水浴揮發溶劑，加入新配置的5%的香草醛－，于60℃水浴中加熱15min，流水冷卻后加入5mL冰乙酸，搖勻，放置15分鐘，以相應試劑做空白對照，用紫外分光光度計在560nm處測得吸光值，繪制標準曲線。標準曲線方程為：A=＋(r2=）。含量測定：，依照標準曲線操作步驟測定。 多肽含量測定 大豆多肽提取液采用BCA法測定肽含量[28]。 取20μL肽液于離心管中，加蒸餾水至2mL，混勻，得100倍稀釋液。取20μL稀釋液，加200μLBCA搖勻，平行三組，一組空白對照，37℃下靜置1h。在562nm處測定吸光值。根據標準曲線測肽含量。 不同提取物抗氧化實驗 體外抗氧化實驗分別測定香菇多糖、三七皂苷、大棗多糖、大豆多肽四種提取物的還原能力、DPPH和羥自由基（OH）清除能力，分別得到清除率曲線并計算出四種物質的IC50值，比較它們抗氧化能力的大小。具體方法如下： 還原能力的測定——鐵氰化鉀還原法[29] 清除DPPH自由基能力——改進的Nagai法[30] DPPH（二苯代苦味酰基自由基）是一種很穩定的自由基，在乙醇溶液中呈現深紫色，在517nm處有最大吸收峰。當有自由基清除劑（AE）存在時其單電子被結合而使其顏色減退，在最大吸收波長處吸光值最小，減小的程度與清除劑的清除能力及數量成定量關系。[31] 采用鄰二氮菲亞鐵法。過氧化氫與亞鐵體系通過Fenton反應產生OH，亞鐵離子可被OH氧化成鐵離子，鄰二氮菲亞鐵在536nm處的最大吸收峰隨之消失。 根據還原能力實驗和自由基清除率實驗結果，得到具有相同還原能力和相同DPPH和OH清除能力下不同提取物的濃度。按照相應的濃度將大豆多肽、三七皂苷和大棗多糖分別與香菇多糖按體積比1:1搭配起來。測定混合物的還原能力、DPPH清除能力及羥自由基清除能力大小，研究其增效作用。 最佳搭配物質與香菇多糖的抗氧化最佳配比實驗 根據提取物與香菇多糖的抗氧化配比增效實驗，得到大豆多肽、三七皂苷和大棗多糖三種代表提取物中的最佳香菇抗氧化增效劑。按照最佳的增效劑和香菇多糖的質量比1:9，2:5，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1進行還原能力、清除DPPH能力和OH能力實驗，綜合得到最佳配比。3結果與討論 四種提取物還原能力測定 香菇多糖、三七皂苷、大棗多糖、大豆多肽的還原能力測定結果見圖1。圖1 還原力曲線Fig. 1 Curve of reducing power 還原能力以測得的吸光值A700大小表征其大小，吸光值越大，測得樣品的還原能力越強。由圖1可知，四種提取物的還原能力在一定濃度范圍均與其濃度呈正相關。在相同的還原能力下，各提取物濃度如下：大豆多肽12mg/mL，大棗多糖6mg/mL，香菇多糖1mg/mL。結果表明：~，在同一吸光值下所需各提取物濃度按三七皂苷、香菇多糖、大棗多糖、大豆多肽的順序遞增；在A700為其他濃度時，四種提取物物也近似呈現類似變化趨勢。故在一定濃度范圍內，四種提取物還原能力大小為：三七皂苷香菇多糖大棗多糖大豆多肽。 四種提取物清除DPPH能力測定 香菇多糖、三七皂苷粗提物、大棗多糖和大豆多肽的DPPH清除率測定結果如圖2所示。圖2 四種提取物對DPPH的清除能力 Ability of scavenging DPPH of extracts 結果可知四種提取物的DPPH清除能力均隨濃度的增大而增大。香菇多糖在4mg/mL時清除率即可達到80%。大棗多糖和三七皂苷DPPH清除率隨濃度的增加而增加的幅度比香菇的小，大豆多肽在濃度0~27mg/mL范圍內DPPH清除率隨濃度的增加變化緩慢，在25mg/mL時清除率達到61%。根據4種提取物的DPPH清除率曲線的回歸方程可計算出這4種物質DPPH 清除率的IC50值，結果見表1。表1 四種提取物DPPH 清除能力IC50值Table 1 IC50 values of scavenging DPPH of all extracts種類回歸曲線方程IC50/(mg/mL)香菇多糖y=++ R2=大豆多肽y=+ R2=大棗多糖y=+ R2=三七皂苷y=++ R2= 據圖2及表1分析得四種物質IC50值大小為：香菇多糖三七皂苷大棗多糖大豆多肽，相同濃度下四種物質的DPPH 清除能力大小為：香菇多糖三七皂苷大棗多糖大豆多肽。其中大豆多肽的DPPH 清除能力較差。 香菇多糖、三七皂苷粗提物、大棗多糖和大豆多肽的OH清除率測定結果如圖3所示。圖3 香菇多糖、大棗多糖、三七皂苷對羥自由基的清除能力 Ability of scavenging OH of Len, JDP an