細胞生物學研究方法-免費閱讀

　　

【正文】 細胞拆合： 就是把核與質分離開來，然后把不同來源的細胞質和細胞核相互配合，形成核質雜交細胞。 細胞 DNA合成一般有兩條途徑 : HAT培養基篩選 : H, 次黃嘌呤 。如皰疹病毒，牛痘病毒，雞瘟病毒和仙臺病毒等．其中常用的是經紫外線照射滅活的仙臺病毒． 誘導細胞融合的方法 仙臺病毒 紫外線 喪失感染活性 （不感染細胞 ） 保留融合活性 （誘導細胞融合） ３ . 電激介導的細胞融合 其中電誘導細胞融合和ＰＥＧ誘導細胞融合是動物細胞融合的常用方法。所謂 轉化 即是指正常細胞在某種因子的作用下發生突變而具有癌性的細胞。 如轉基因、基因敲除、被標記等 。 一 顯微分光光度測定技術 二 流式細胞術 流式細胞術是用流式細胞儀分離篩選細胞或測定細胞組分的一 種技術 由細胞流動室、光源（激光）、信號檢測器、計算機分析處理 系統四部分組成 用途： 對單個細胞進行 快速定量分析與分選 。 利用這樣的特性 ， 用放射性化合物脈沖標記活細胞 ,經固定 、 切片后在暗處把感光乳膠覆蓋于切片上 ,在此期間 ,由于放射性同位素衰變使乳膠曝光 ,經顯影 、 定影 ,根據銀粒所在部位 ,就可知道細胞中放射性物質的分布 。 免疫電鏡技術中 最關鍵的問題同樣是保持樣品中蛋白的抗原性 ， 并且要設立嚴格的對照 。標本處理有多種方法，組織切片、冰凍切片都可應用，其宗旨只有一個， 即要盡量完好地保持被檢測蛋白的抗原性 ；免疫染色就是抗原抗體反應的過程，這里要注意設立各種實驗對照以檢驗結果的可靠性。 免疫細胞化學技術 與免疫電鏡是最常見的研究細胞內蛋白質分子定位的重要技術 。 Schiff試劑中的 無色品紅 與醛基反應，形成含有醌基的化合物，醌基為發色團，呈現出紫紅色。 差速離心 低速離心 中速離心 高速離心 超高速離心 細胞勻漿 細胞 核仁 細胞骨架 大細胞器 小細胞器 核糖體 大分子 等密度離心法： 按細胞組分的浮力密度不同進行分離的方法。 可在真空 、 大氣 、 常溫等不同環境下工作 ， 甚至可將樣品浸在水和其它溶液中 ， 不需要特別的制樣技術 ， 并且探測過程對樣品無損傷 。 ? 分辨力為 6~10nm，由于人眼的分辨力（區別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為 ，掃描電鏡的有效放大倍率為 20220X。 三 冰凍蝕刻技術 ① 將標本于 100℃ 干冰中或 196℃ 液氮中，超低溫冰凍。 染色 :生物分子由原子序數低的輕元素組成 , 散射電子能力弱 , 無明暗反差 ,需進行染色。 電鏡的分辨本領 : 是指電鏡處于最佳狀態下的分辨率 。 與相差顯微鏡相比 ， 其標本可略厚一點 ， 折射率差別更大 ， 故影像的立體感更強 。 蠑螈肺細胞的有絲分裂 (240x), 熒光。 嗜酸 性結構則通常由細胞內及細胞間的 蛋白質 ，如路易體（ Lewy body）、酒精小體（ Mallory body）、細胞質的大部分等。 ?構成： （ 1）光學放大系統 : （ 2）照明系統： （ 3）機械和支架系統 ?原理： 經物鏡形成倒立實像， 經目鏡進一步放大成像。 這種染色方法的基礎是組織結構對不同染料的結合程度不同。 即：物質吸收短波光，發射出的長波光。 綠色熒光蛋白改造的蜜蜂 相差顯微鏡 （ phasecontrast microscope） 是一種將光線通過透明標本細節時所產生的光程差 （ 即相位差 ） 轉化為光強差的特種顯微鏡 。將微分干涉顯微鏡接上錄像機，可以觀察活細胞中的顆粒及細胞器的運動。 脫水 :等級梯度脫水，用脫水有利包埋。 電子密度高、電子密度低 ：被重金屬浸染呈黑色的結構，稱電子密度高；反之，淺染的部分稱電子密度 用 重金屬鹽 （如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品 進行 染色 ；吸去染料，樣品干燥后，樣品 凹陷處 和 樣品周圍 鋪 了一薄層重金屬鹽，而 凸出處 則沒有染料沉積，從而出現負染 效果，分辨力可達 。 ④ 復膜顯示出了標本蝕刻面的形態 ， 撈于載網上干燥后可置于透射電鏡下觀察 。如果探針與物體的距離發生變化，這股電流也會相應的改變。 一般步驟 ： 勻漿化 離心處理 收集分析 （一）差速離心 Differential centrifugation ? 主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器 。 ? 利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括糖類、脂類、核酸、酶等。多用蘇丹染料、油紅 O、尼羅藍等溶于脂類的染料染色，使脂質呈色。 實質 就是用結合有 熒光素 的抗體與組織內抗原反應，在熒光顯微鏡下觀察抗原的存在部位。 也可以先用一種抗體 （ 第一抗體 ） 結合到抗原部位然后用可以識別第一抗體 。 原位雜交技術首先是在光鏡水平上發展起來的， 放射性同位素 標記的探針與樣品中的 DNA或 RNA雜交后，用顯微放射自顯影的方法顯示雜交物的存在部位；或用 熒光素 標記的探針進行雜交，在熒光顯微鏡下直接顯示與探針雜交的核酸存在部位。 根據細胞成分所具有的這種特性 ， 可利用細胞分光光度計對一定的成分進行定位 、 定性測定 。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養，但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。 細胞系 （ cell line） : 當培養細胞分裂增殖相互間密切接觸時，細胞停止活動的現象為接觸抑制。 兩個細胞正在融合 細胞膜的流動性是動物細胞融合的生物學基礎。 脾細胞 (B淋巴細胞 ) 骨髓瘤細胞 雜交瘤細胞 分泌抗體 長命 分泌抗體 短命 長命 不分泌抗體 （二） HAT培養基篩選 的原理 免疫脾細胞 經抗原免疫的 BALB/c小鼠的脾臟 小鼠骨髓瘤細胞 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(HGPRT),胸腺嘧啶激酶（ TK） － 缺陷型 親本細胞 主途徑：是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA， 葉酸 作為重要的輔酶參與這一合成過程。 這種核移植必須用顯微操縱儀進行操作 。 顯微操作儀 現在顯微操作裝置的設計越來越精密，已經有可能對細胞核進行解剖和注入微量物質（如核酸分子片段）。 脾細胞 (B淋巴細胞 ) 骨髓瘤細胞 雜交瘤細胞 脾細胞 /?脾細胞 骨髓瘤細胞 / ?骨髓瘤細胞 骨髓瘤細胞 脾細胞 不能長期存活 不能長期存活 單克隆抗體制備示意圖