細胞生物學研究方法-預覽頁

　

【正文】 實像， 經目鏡進一步放大成像。E染色 ”（ hematoxylin and eosin stain、HE stain），是組織學最常用的染色方法之一。 嗜酸 性結構則通常由細胞內及細胞間的 蛋白質 ，如路易體（ Lewy body）、酒精小體（ Mallory body）、細胞質的大部分等。 什么是熒光？ 當一個物體吸收了紫外光（短波光）的能量，物質中的電子吸收光的能量由低能狀態轉變為高能狀態，再回到低能狀態時釋放出比原來吸收的波長更長的光為“熒光”。 蠑螈肺細胞的有絲分裂 (240x), 熒光。查爾菲和錢永健。 與相差顯微鏡相比 ， 其標本可略厚一點 ， 折射率差別更大 ， 故影像的立體感更強 。 微分干涉顯微鏡還可用于研究活細胞中較大的細胞器。 電鏡的分辨本領 : 是指電鏡處于最佳狀態下的分辨率 。 1. 超薄切片技術 二、主要電鏡制樣技術： 超薄切片 銅網 取材 :要快，避免損傷，標本必須薄，小 固定 :常用戊二醛和四氧化鋨固定，四氧化鋨除與蛋白共價結合外 ,還對脂類有良好的固定效果。 染色 :生物分子由原子序數低的輕元素組成 , 散射電子能力弱 , 無明暗反差 ,需進行染色。 標本在熒光屏上呈黑白反差的結構影像。 三 冰凍蝕刻技術 ① 將標本于 100℃ 干冰中或 196℃ 液氮中，超低溫冰凍。 噴碳后 將樣品浸泡于腐蝕液中將生物組織腐蝕掉，只剩下鉑－碳復型膜。 ? 分辨力為 6~10nm，由于人眼的分辨力（區別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為 ，掃描電鏡的有效放大倍率為 20220X。如果探針距離物體表面很近 —— 大約在納米級的距離上電子會穿過物體與探針之間的空隙，形成一股微弱的電流。 可在真空 、 大氣 、 常溫等不同環境下工作 ， 甚至可將樣品浸在水和其它溶液中 ， 不需要特別的制樣技術 ， 并且探測過程對樣品無損傷 。 離心機： 普通： 8000rpm以下； 高速： 8000~25000rpm； 超速： 25000rpm以上，達十幾萬 rpm。 差速離心 低速離心 中速離心 高速離心 超高速離心 細胞勻漿 細胞 核仁 細胞骨架 大細胞器 小細胞器 核糖體 大分子 等密度離心法： 按細胞組分的浮力密度不同進行分離的方法。 密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體 CsCl 密度梯度離心分離 DNA 密度大于 ? 原理： 利用一些顯色劑與所檢測物質中一些特殊基團特異性結合的特征 ， 通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布和含量 。 Schiff試劑中的 無色品紅 與醛基反應，形成含有醌基的化合物，醌基為發色團，呈現出紫紅色。標本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。 免疫細胞化學技術 與免疫電鏡是最常見的研究細胞內蛋白質分子定位的重要技術 。 常用的螢光素有異硫氰酸熒光素 (FITC)、 羅丹明 (rhodamine)等 。標本處理有多種方法，組織切片、冰凍切片都可應用，其宗旨只有一個， 即要盡量完好地保持被檢測蛋白的抗原性 ；免疫染色就是抗原抗體反應的過程，這里要注意設立各種實驗對照以檢驗結果的可靠性。 膠體金可以直接與抗體連接形成免疫金 ， 導至抗原部位 ， 稱為直接免疫法 。 免疫電鏡技術中 最關鍵的問題同樣是保持樣品中蛋白的抗原性 ， 并且要設立嚴格的對照 。 核酸雜交原理 原位雜交 (in situ hybridization)： 在不破壞細胞或細胞器的情況下，用核酸探針檢測特定核苷酸序列在染色體上的精確位置的技術，稱為原位雜交(in situ hybridization)。 利用這樣的特性 ， 用放射性化合物脈沖標記活細胞 ,經固定 、 切片后在暗處把感光乳膠覆蓋于切片上 ,在此期間 ,由于放射性同位素衰變使乳膠曝光 ,經顯影 、 定影 ,根據銀粒所在部位 ,就可知道細胞中放射性物質的分布 。 顯微分光光度測定技術 流式細胞術 細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜 ， 核酸 (260nm)、 蛋白質 (280nm)、 細胞色素 、 維生素等都有自己特征性的吸收曲線 。 一 顯微分光光度測定技術 二 流式細胞術 流式細胞術是用流式細胞儀分離篩選細胞或測定細胞組分的一 種技術 由細胞流動室、光源（激光）、信號檢測器、計算機分析處理 系統四部分組成 用途： 對單個細胞進行 快速定量分析與分選 。 是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養。 如轉基因、基因敲除、被標記等 。 如果細胞能無限傳代培養，稱為永生化細胞系（ immortal cell line）。所謂 轉化 即是指正常細胞在某種因子的作用下發生突變而具有癌性的細胞。 細 胞 融 合 同核融合細胞 ： 基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體 (homokaryon)； 異核融合細胞 ： 來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體 (heterokaryon)。如皰疹病毒，牛痘病毒，雞瘟病毒和仙臺病毒等．其中常用的是經紫外線照射滅活的仙臺病毒． 誘導細胞融合的方法 仙臺病毒 紫外線 喪失感染活性 （不感染細胞 ） 保留融合活性 （誘導細胞融合） ３ . 電激介導的細胞融合 其中電誘導細胞融合和ＰＥＧ誘導細胞融合是動物細胞融合的常用方法。sar Milstein 英國 英國醫學研究委員會 分子生物實驗室 1927年 三 . 單克隆抗體的概念和原理 由單一克隆的 雜交瘤細胞 分泌的抗體，只針對于一個抗原決 定簇 —— 單克隆抗體 抗原分子表面具有特殊立體構型和免疫活性的化學基團稱為抗原決定簇。 細胞 DNA合成一般有兩條途徑 : HAT培養基篩選 : H, 次黃嘌呤 。 物理法 ：用機械方法或短波光把細胞核去掉或失 活 ， 然后用微吸管吸取其它細胞的核 ， 注入去核的細胞質中 ， 組成新的雜交細胞 。 細胞拆合： 就是把核與質分離開來，然后把不同來源的細胞質和細胞核相互配合，形成核質雜交細胞。 注射吸管 固定吸管 DNA 思考題： 1. 如何分離分析細胞組分？ 2. 什么是原位雜交？ 3. 單克隆抗體技術原理？ 4. 原代培養、傳代培養、 5. 細胞系、細胞株、細胞融合（細胞雜交）