細胞生物學研究方法(存儲版)

　　

【正文】 三 細胞拆合及顯微操作技術 細胞拆合方法： 可以分為物理法和化學法兩種類型 。hler 德國 巴塞爾免疫研究所 1946年 1995年 米爾斯坦 C233。 （一） 細胞融合的概念 細胞融合（ cell fusion）又稱細胞雜交（ cell hybridization）是指在自然條件下或人工方法（物理，化學，生物等方法）將不同種生物或同種生物不同類型兩個或多個真核細胞合并成一個雙核或多核細胞的生物學現象和過程。 如果細胞能連續傳代培養的，稱為連續細胞系（ continuous cell line）。 一 細 胞 培 養 （一） 動物細胞培養 （二） 植物細胞培養 第三節 細胞培養 、 細胞工程與顯微操作技術 細胞培養 就是將動植物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞或直接以單細胞 生物，給予必要的生長條件，讓其在培養瓶中或培養基上繼續生長與增殖。下面介紹二種細胞化學的定量分析方法。 （ 2）免疫電鏡技術 體外培養的 BHK21細胞經選擇性抽提后用抗 280kD核骨架蛋白抗體進行免疫膠體金標記的結果 IF： 中間纖維； g： 金顆粒； N： 核區。 當用免疫球蛋白包被膠體金后則稱為免疫金 ， 是一種在光鏡或電鏡下易辨認的標記物 。 ?間接法 ?直接法 將帶有標記的抗體與抗原反應 ，顯示出抗原存在的部位 在抗體抗原初級反應的基礎上 ， 再用帶標記的次級抗體與初級抗體反應 ， 從而使初級反應得到放大 ， 增強顯示效果 Antigen presenting Cell Enzymeconjugated Primary Antibody Substratechromogen solution ?直接法 將帶有標記的抗體與抗原反應 ，顯示出抗原存在的部位 間接免疫細胞化學法的原理示意圖 次級 抗體 初級 抗體 標記物 第一抗體（一抗） 第二抗體（二抗） Primary Antibody Enzymeconjugated Secondary Antibody Antigen presenting Cell Substratechromogen solution 間接法 （一）免疫熒光技術 免疫熒光技術 就是將免疫學方法 （ 抗原抗體特異結合 ） 與熒光標記技術相結合用來研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法 。 Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme (nucleotide diphosphatase) in the Golgi apparatus. A thin section of the cell was incubated with a substrate that formed an electrondense precipitate upon reaction with the enzyme 脂類物質包括脂肪和類脂。 ?常用介質： 氯化銫 、 蔗糖 、 多聚蔗糖 。 1924年 svdberg發明了世界上第一臺分析超速離心機。 掃描隧道顯微鏡原理 示意圖 探針和物體之間加上電壓。 噴金 , 90176。 分辨率 。這種切片需要用超薄切片機制作。目前像基因注入、核移植等生物工程的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。 WHAT IS CONFOCAL MICROSCOPY ?The resolution of images obtained with conventional microscopy are seriously deteriorated by the contamination of the image plane with outoffocus light WIDEFIELD CONFOCAL 共聚焦掃描顯微鏡的成像基本原理 分辨率可以比普通熒光顯微鏡的分辨率提高 ～ 由于點對點掃描去除了雜散光的影響 conventional confocal 可獲取連續光學切片 優點： 多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個被標記物 LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) 2022年的諾貝爾化學獎授予了從事有關“綠色熒光蛋白質的發現 ,表達和發展”并取得重要成就的三位科學家 :下村修、馬丁 誘發熒光 :一些細胞成分本身經紫外線照射后不發熒光，但用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖叮橙等熒光色素）進行活體染色或固定后切片染色，就能在熒光鏡下看見熒光，這種熒光叫誘發熒光。 常用固定劑： 甲醛、戊二醛、乙醇 ② 包埋： 便于切片，防止樣品移位 ,常用包埋劑：石蠟 ③ 切片： 生物樣品太厚，不能直接用光鏡觀察，需切成 1～10μ m的薄片 ④ 染色 : 蘇木精－ 對負電荷分子有親和力，可顯示細胞內核酸的分布 伊 紅 －可使細胞質染色 光學顯微鏡的樣品制備與觀察 蘇木精 伊紅染色 ，又稱“蘇木素 伊紅染色”，或“ Hamp。 放大倍數 ＝ 目鏡 的放大倍數 X物鏡 的放大倍數 人眼的分辨能力在 mm左右 ① 固定： 可使生物大分子交聯，蛋白質成分凝固，防止細胞自溶和破壞而產生人工假象。 特點： 光源為紫外線 ， 波長較 短 ， 分辨力高于普通顯微鏡； 自發熒光 :由細胞本身存在的物質經紫外線照射所發出的熒光。 放大 1600倍的人類精子細胞 （三）激光共聚焦掃描顯微 鏡 是在熒光顯微鏡成像的基礎上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發出熒光，利用計算機進行圖像處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像的一種光學顯微鏡。 DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色） 微分干涉差顯微鏡的應用： (Differentialinterference microscope)DIC顯微鏡使細胞的細微結構立體感特別強，適合于顯微操作。 由于電子束穿透力很弱，因此用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅 20－ 50nm 的超薄切片，并放在銅網上。 透射電鏡標本制備過程 : 觀察組織、細胞 內部超微結構 。 ③ 標本蝕刻后， 再向斷裂上以 45176。 掃描電子顯微鏡 生物