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細胞生物學研究方法-文庫吧在線文庫

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【正文】樣品制備的基本操作程序掃描電鏡照片展示不同倍率的果蠅掃描電鏡照片掃描電鏡照片展示可以用計算機將黑白照片處理成彩色掃描電鏡照片展示人類精子（三）掃描隧道顯微鏡 Scanning Tunneling Microscope，分辨率： XY向（原子級分辨率）掃描隧道顯微鏡是用來顯示物質(zhì)表面原子排布的一種顯微鏡，它是根據(jù)量子力學中的隧道效應而設計的。掃描隧道顯微鏡的優(yōu)越之處：第二節(jié) 細胞組分的分析方法一、用超離心技術分離細胞器與生物大分子及其 b 復合物二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯 b 示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性一、用超離心技術分離細胞器與生物大分子及其合物各種離心技術 —— 離心是研究亞細胞成分和生物大分子的基本手段。常將樣品通過高濃度的蔗糖或氯化銫的密度梯度沉降在達到與自身密度相等的位置就停滯不再向下沉降。酶組織化學染色法基本原理：是利用酶對其相應底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反應產(chǎn)物與某種試劑發(fā)生反應，形成沉淀或有色的最終產(chǎn)物，借此檢測該酶在組織切片或細胞內(nèi)的分布及活性強弱。常用的標記方法： 1)熒光標記：異硫氰酸熒光素（ FITC）、羅丹明 2)酶標記：辣根過氧化物酶（ HRP） 3)膠體金標記：即金的水溶液，具有一般溶液的特性，用它與抗體標記后，經(jīng)抗原抗體反應可定位抗原的存在。由于膠體金顆粒可以制成預定的大小，形態(tài)規(guī)則，電子密度高，對細胞無毒性等優(yōu)點，故是當今最為廣泛的標記物。免疫電鏡技術至今已在以下方面得到廣泛應用，如：蛋白分泌的研究，通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；一些結構蛋白的研究，包括膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。五、放射自顯影術六定量細胞化學分析技術前面介紹了細胞內(nèi)不同成分的細胞化學定性與定位方法，然而蛋白或核酸等生物大分子在某個細胞中或細胞群體中的含量分析對了解該物質(zhì)的生物學功能是十分重要的。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計。如果傳代培養(yǎng)不超過 10左右，稱為有限細胞系（ finite cell line）。 ? 類型：就技術范圍而言，大致有細胞融合技術、細胞拆合技術、細胞組織培養(yǎng)技術和胚胎移植技術等。 A 低產(chǎn) 抗倒伏 B 高產(chǎn) 易倒伏 AB 雜交細胞高產(chǎn) 抗倒伏細胞融合 (雜交 ) ? 在生命科學中應用價值極大的單克隆抗體的制備技術就是在細胞融合技術上發(fā)展起來的．單克隆抗體的誕生，導致了免疫學技術的革命．這項技術或１９８４年諾貝爾醫(yī)學及生理學獎．應用： ?疾病的論斷和治療 (生物導彈 ) ?生物大分子的鑒定、定位和分離純化 ?細胞器的鑒定、定位和分離 ?特定細胞或病毒的鑒定、定位和分離二單克隆抗體技術榮獲 1984年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎發(fā)明單克隆抗體技術杰尼 Niels K. Jerne 丹麥巴塞爾免疫研究所 1911年 1994年科勒 Gees . K246。可阻斷內(nèi)源性的 DNA的合成。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機械裝置。化學法：用松胞素 B處理細胞，細胞出現(xiàn)排核現(xiàn)象，再結合離心技術，將細胞分拆為核體和胞質(zhì)體兩部分。可被氨基喋呤阻斷輔助途徑：是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng) 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（ HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（ TK）的催化作用合成 DNA。細胞融合就是利用細胞膜的這一特性，通過對參與融合的細胞施加生物、化學、或物理誘導因素，使細胞膜的脂類分子有序排列發(fā)生改變；當誘導因素解除后，細胞膜恢復原有的有序結構，在恢復過程中便可誘導相接觸的細胞發(fā)生融合。（非正常細胞如癌細胞除外）。原代培養(yǎng) （ primary culture）：大都取自動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細胞顯微分光光度測定法可分為紫外光顯微分光光度測定法與可見光顯微分光光度測定法。原位雜交技術在顯微與亞顯微水平上研究基因定位、特異mRNA表達等問題的研究中起重要作用。的另一抗體（第二抗體）把標記物（膠體金）引入同一部位。也可分為直接法和間接法。也可用四氧化鋨（ OSO4）染色，脂肪酸或膽堿可使 OSO4還原為 OSO2而呈黑色。二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法核酸顯示方法－－－－ Feulgen反應 Feulgen和 Rossenbeck (1924)發(fā)明，對 DNA的反應具有高度專一性。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。這樣，通過測量電流我們就能知道物體表面的形狀，原子級高分辨率。電鏡下的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構。示肌動蛋白纖維二負染色（ negative staining）技術 Figure 329. Electron micrograph of negatively stained actin filaments. Each filament is about 8 nm in diameter and is seen, on close inspection, to be posed of a helical chain of globular actin molecules. (Courtesy of Roger Craig.) V. Negative Staining and Cryoelectron Microscopy Allow Macromolecules to Be Viewed at High Resolution 亦稱冰凍斷裂 (freezefracture)，是研究生物膜內(nèi)部結構的一種有用的技術，關于膜結構的許多資料即是利用這種方法取得的。包埋 :為制成超薄切片 ,并使切片耐受高真空、電子轟擊 , 切片前需包埋 ,常用環(huán)氧樹脂。二、電子顯微鏡一、分類：透射電子顯微電鏡（ Transmission electron Microscope TEM）掃描電子顯微電鏡（ Scanning electron Microscope SEM ）掃描隧道顯微鏡名稱波長 (n m) 可見光 760 390 紫外光 3

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