基因診斷與基因治療培訓教程(編輯修改稿)

　

【文章內容簡介】 alcancer）基因失活是結腸癌發展的晚期事件。抑癌基因 DPC4和MADR2也可能會因 18q等位基因丟失而失活。p53基因的突變是結腸癌發展過程的晚期現象。DNA修復基因也與結腸癌有關。如 hMSHhMLH hPMS1或 hPMS2基因的突變所致的 DNA錯配修復缺陷與遺傳性非息肉性結腸癌的發生有關。二、常見腫瘤的基因診斷目 錄目 錄（ 1） PCRSSCP法： 對腺瘤樣息肉病人 APC基因 PCRSSCP技術進行分析。（ 2）異源雙鏈 PCR法： 檢測 APC基因變異。（ 3）蛋白質免疫印跡法： 檢測因基因突變而縮短了的 APC蛋白。2．結腸癌基因診斷方法第五節 基因診斷在法醫學上的應用Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine目 錄目 錄目 錄n 重復序列以各自核心序列（重復單元）首尾相連多次重復，稱為串聯重復序列，其重復次數在人群中存在變異，形成多態性。n 串聯重復序列散在分布于染色體上。n 重復單位 6～ 25bp長，稱為小衛星 DNA。重復單位 2～ 6bp長，如（ TA） n,(CGG)n等，稱為微衛星 DNA。一、 DNA指紋與多態性遺傳標記目 錄目 錄可變數目串聯重復序列 (VNTR)人類染色體上小衛星 DNA的高度可變區（HVR）是由頭尾相連的串聯重復序列（tandem repeat， TR）組成， TR的核心序列同源性很高，等位 HVR的長度由于 TR的重復次數不同而有很大的差別，具高度多態性。目 錄目 錄DNA長度多態除可用 Southern印跡雜交法檢測外，還可以通過 PCR擴增后電泳來檢出。擴增片段長度多態（ amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AmpFLP）1985年，英國遺傳學家Jeffeys等人用 TR的核心序列為探針進行 RFLP分析時，檢測到許多HVR，并產生相應的圖譜，所得圖譜具有高度的個體特異性，達到了如同人類指紋那樣的高度專一性，所以稱其為DNA指紋圖譜（ DNAfingerprinting）。 Alec John JeffreysOxford, United Kingdom 目 錄目 錄目 錄人類 DNA指紋圖目 錄目 錄二、 DNA指紋與法醫學診斷n 個體識別和親子鑒定： DNA指紋技術是從基因水平檢測 DNA的高度多態性，個體識別率高。n 以往在刑事案件的法醫學鑒定中應用的是血型、血清蛋白型、紅細胞酶型和 HLA分型，個體分辨能力不夠，只能排除，不能做到統一認證。目 錄目 錄法醫案檢中的基因診斷技術n VNTR（可變數目串聯重復序列 /小衛星）的核酸分子雜交分析n STR（短串聯重復序列 /微衛星）的 PCR分析n SNP的基因芯片檢測目 錄目 錄1．單位點探針檢測及 PI值的計算父權指數（ PaternityIndex， PI）值、父權相對指數或親子關系概率值計算方法基本一致。PI值表示爭議父作為親父比隨機男人作為親父的可能性大多少倍， PI值大于 1表示傾向肯定父子關系，數值越大，可能性越大；等于0時表示排除父子關系 。目 錄目 錄2． DNA指紋圖與親權鑒定多位點 VNTR系統和 DNA指紋圖的電泳分離后片段數目較多，各等位基因頻率分布的計算復雜，進行親權鑒定和個體識別時匹配概率的計算影響因素較多，目前尚無一個公認的最合理的計算方法。目前解決親權糾紛最簡單的辦法是先在孩子 DNA指紋圖中找出非母片段并計數為 P，然后分析爭議父 DNA指紋圖，看 P條非母帶在爭議父中出現多少條。目 錄目 錄親權鑒定與 DNA指紋圖由此圖可推斷出： A和 C是親生女兒； B為妻子和其前夫所生； D為養女。 第六節 基因治療的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy目 錄n 基因治療： 指將目的基因通過基因轉移技術（病毒載體介導或者非病毒載體介導的基因轉移技術）導入靶細胞內，目的基因表達產物對疾病起治療作用。 目 錄 狹義基因治療： 指目的基因導入靶細胞后與宿主細胞內的基因發生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因表達產物起治療疾病的作用。 廣義基因治療： ① 外源正常基因導入病變細胞，產生正常基因的表達產物以補充缺失的或失去正常功能的蛋白質； ② 采用適當的技術抑制細胞內過度表達的基因； ③ 將特定的基因導入非病變細胞，在體內表達特定產物； ④ 向功能異常的細胞（腫瘤細胞）中導入該細胞中本來不存在的基因（如自殺基因），利用這些基因的表達產物達到治療疾病的目的。目 錄本節內容提要 一、基因治療的策略二、基因轉移技術三、基因干預四、基因治療的應用研究五、基因治療的前景與問題目 錄目 錄基因治療分類216。 體細胞 (somaticcell)基因治療216。 生殖細胞 (germline)基因治療v 只限于某一體細胞的基因的改變v 只限于某個體的當代v 對缺陷的生殖細胞進行矯正v 當代及子代目 錄目 錄 一、基因治療的策略目 錄 （一）基因置換 （ genereplacement） 定義： 指將特定的目的基因導入特定細胞，通過定位重組，導入的正常基因，以置換基因組內原有的缺陷基因。 目的： 將缺陷基因的異常序列進行橋正。 對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任何改變。 目 錄n 定向整合的條件 :轉導基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換。n 基因同源重組技術又稱為 基因打靶 (genetargeting）n 細胞內基因同源重組的發生率很低。基因同源重組技術目 錄（二） 基因添加 （ geneaugmentation） 定義 : 通過導入外源基因使靶細胞表達其本身 不表達的基因。類型 :n 在有缺陷基因的細胞中導入相應的正常基因，而細胞內的缺陷基因并未除去，通過導入正常基因的表達產物，補償缺陷基因的功能；n 向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產物達到治療疾病的目的。目 錄（三）基因干預 （ geneinterference） 定義： 采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結構而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。目 錄n 定義： 將 “自殺 ”基因導入宿主細胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產生 “自殺 ”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。n 應用： 是惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。（四）自殺基因治療 (SuicideGeneTherapy)目 錄目 錄自殺基因的作用機制 目 錄?TK/GCV單純皰疹病毒（ herpssimplexvirus,HSV） Ⅰ 型胸苷激酶（ thymidinekinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ ganciclovir,GCV） 轉變成毒性 GCV三磷酸核苷，后者能抑制 DNA聚合酶活性，導致細胞死亡。目 錄定義 :“自殺基因 ”導入后，不僅使轉導了 “自殺基因 ”的腫瘤細胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉導 “自殺基因 ”的腫瘤細胞也被殺死。 2.旁觀者效應（ bystandereffect）目 錄 （五）基因免疫治療通過將抗癌免疫增強的細胞因子或 MHC基因導入腫瘤組織，以增強腫瘤微環境中的抗癌免疫反應。 目 錄二、基因轉移技術 基因治療的兩種途徑載體目的基因in vivoex vivo 靶細胞目 錄目 錄基因轉移 (genetransfer)技術 目 錄 病毒載體 介導的基因轉移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據統計，有 72%的臨床實驗計劃和 71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是反轉錄病毒載體 。目 錄反轉錄病毒的結構及生活周期（ 1）反轉錄病毒 目 錄p 兩端各有一長末端重復序列 LTR。 反轉錄病毒前病毒的結構特點p LTR由 U R和 U5三部分組成。p 病毒有三個結構基因p 5ˊ端 LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ ψ）及剪接供體位點 (SD)和剪接受體位點 (SA)。p 含有負鏈 DNA轉錄的引物結合位點 (PBS)和正鏈 DNA轉錄的引物結合位點 。l 在 U3內有增強子和啟動子； l U3和 U5兩端分別有病毒整合序列 (IS)；l 在 R內還有 poly(A)加尾信號。l gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；l pol基因，編碼反轉錄酶；l env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白 (包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白 )。目 錄反轉錄病毒介導的基因轉移系統—— 由兩部分組成反轉錄病毒載體： 其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號 ψ，而缺失病毒的包裝蛋白基因；它可以克隆并表達外源治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。 輔助細胞株 (如 PA317)： 由另一種缺陷型反轉錄病毒（即帶有全套病毒包裝蛋白基因，但缺失包裝信號 ψ的反轉錄病毒）感染構建而成。能合成包裝蛋白，用于反轉錄病毒載體包裝，但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒。 目 錄目 錄Retroviralpackagingsystem目 錄反轉錄病毒載體的特點① 反轉錄病毒包膜上 env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使反轉錄病毒攜帶的遺傳物質高效地進入靶細胞。160